申请日：2017.01.08
公开(公告)日：2017.05.24
IPC分类号：C12N1/02; C12Q1/68; C02F3/34
摘要：
一种污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌的分离方法，属于污水生物处理技术领域。本发明可以分离污水处理厂活性污泥中对碳源种类需求不同的自养菌与异养菌的DNA，从基因水平上分析两种菌群的特点。采用13C标记的无机物或有机物作为碳源原位培养污水厂活性污泥，采用稳定性高、分离效果好的氯化铯超高速密度梯度离心法分离得到不同层级的DNA溶液。分离之后各层级溶液的密度按照离心管从下到上的方向对应从大到小减少。采用实时定量PCR技术和高通量测序技术分析5 9层级的DNA样品的微生物群落特征。本发明提供了一种经济、简便、可靠的污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌DNA的分离方法
说明书
污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌的分离方法
技术领域
本发明涉及一种污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌的分离方法，属于污水生物处理技术领域，用于对污水生物处理系统中自养菌与异养菌的分离。
背景技术
污水生物脱氮技术由于经济、高效的特点被广泛应用于污水处理领域。传统的污水生物脱氮包括硝化过程和反硝化过程。其中硝化过程指好氧条件下游离氨和铵盐被氧化成亚硝酸盐和硝酸盐的生物过程。硝化过程由特定的化能自养菌完成。化能自养菌生物量合成所需的碳源来自溶解的CO2，能量来源于将氨氧化为亚硝酸盐和硝酸盐的过程。反硝化过程指缺氧条件下硝化过程产生的亚硝酸盐和硝酸盐被还原为氮气并从污水中脱除的过程。反硝化过程由异养菌完成，其细胞合成需要有机碳源，同时需要有机碳作为电子供体还原亚硝酸盐和硝酸盐。因为硝化过程和反硝化过程对溶解氧和碳源的需求不同，所以实际运行工艺中将硝化过程和反硝化过程从时间上或空间上分开。随着人们对生物脱氮技术的深入研究，在很多污水生物处理系统的好氧区发现了明显的总氮损失现象，总氮损失率高达50%以上。实现好氧区总氮损失将大大简化生物脱氮工艺并提高脱氮效率，从而节省投资、提高处理效率，也可以节省碳源。好氧区总氮损失过程中，异养反硝化菌在自养硝化菌为优势的好氧环境中发挥作用，这一点对于低C/N比生活污水的处理意义重大，有悖于传统自养硝化、异养反硝化的过程，所以不同微生物菌群对碳源的需求情况与代谢机理是好氧区总氮损失的一个核心问题。稳定同位素和分子生物学技术的快速发展为污水生物处理系统内微生物特性研究提供了新的分析方法和手段。因此，采用稳定同位素核酸探针技术对不同菌群微生物的DNA进行培养分离，并用分子生物学技术分析分离后的DNA样品，研究标记后微生物的菌群特点，能够为污水生物脱氮系统的长期稳定运行提供有力保障。
稳定同位素核酸探针技术，是将复杂环境中微生物物种组成及其生理功能耦合分析的有力工具，该技术可以直接甄别复杂环境中微生物的物种组成及其生理功能，从群落水平分析重要微生物生理生态过程的分子机制。稳定同位素核酸探针技术与PCR技术、实时荧光定量PCR技术以及高通量测序技术的结合，可以在更高更复杂的整体水平上定向发掘复杂环境中的重要微生物资源，研究微生物的生理生态功能。目前对自养菌与异养菌的鉴别，局限于对可分离纯化菌种的研究，即通过投加无机或有机碳源测定微生物的生长情况，分析微生物对碳源的代谢量和微生物的增长量，从而确定微生物对碳源的代谢类型。这种方法不适用于污水处理厂活性污泥混合液中微生物自养或异养种类的鉴定。因为活性污泥混合液中微生物种类繁杂，无法精准确定混合液中哪种微生物代谢了投加碳源，更不能分别研究自养菌与异养菌的微生物特性。而稳定同位素核酸探针技术可将自养菌与异养菌定向分离，并可进一步借助分子生物学技术研究分离后各菌种的特性，分析好氧区总氮损失过程中各菌种的代谢功能，阐述总氮损失的形成机制。
本发明采用稳定同位素核酸探针技术标记并分离污水生物处理好氧区总氮损失过程中菌种的DNA，并用PCR技术、实时荧光定量PCR技术以及高通量测序技术分析分离后的DNA样品，从而鉴别活性污泥系统中的自养菌与异养菌对好氧区总氮损失的贡献。本发明在技术上不同于现有技术，主要体现在以下三方面：
(1)培养目标菌群的方法。现有技术对自养菌与异养菌的鉴定主要针对纯化分离的纯菌。纯化分离过程每次只能获得一种微生物，花费时间长、成本高。而且纯培养环境不同于污水处理厂的实际环境，纯化培养后微生物发挥的作用也不同于微生物在污水处理厂活性污泥中的作用，更不能体现水厂活性污泥中特定微生物与环境中其它微生物之间的相互关系，无法探究微生物在水厂复杂环境中的生理特点。本发明原位培养污水处理厂活性污泥中的微生物菌群，不改变微生物的生长环境，并且可以定向分离自养菌与异养菌，进一步分别研究两种菌群的微生物特性。水厂活性污泥受废水污染，其中含有大量未知的有机、无机污染物、颗粒物、杂质等，还有其它大量共存的菌胶团细菌，对目标微生物的原位培养干扰较大，需要对原位培养的条件进行探索和优化。
(2)稳定同位素的作用。目前，稳定同位素主要应用于地质、水文、环境等领域对同位素丰度的检测，从而分析引起同位素含量与分布不同的环境因素。其在水污染治理中的应用，一方面是作为示踪剂推测水体中污染源的来历，分析污染物随时间的迁移与变化，从而达到对已发生的污染事件进行仲裁、了解污染物的转化途径等目的。另一方面是探究微生物对某一污染物的代谢过程以及代谢产物，研究的目标是获得能够代谢污染物的特定微生物。本发明是利用污水处理系统中微生物对碳源种类需求不同的特点，以含13C的碳源为标记底物，原位培养污水处理厂活性污泥，在微生物中合成13C-DNA，进一步利用超高速密度梯度离心法将混合液中不同特性微生物的DNA分离，研究分离后的DNA即可获得混合液中微生物的分子生物学特性。
(3)菌群分析的方法。污水处理厂发挥作用的活性污泥中有大量微生物，目前可借助特定的引物或探针研究活性污泥中具有特殊功能的微生物，例如具有脱氮功能的硝化菌和反硝化菌、具有除磷功能的聚磷菌或聚糖菌等。本发明是从微生物营养类型的角度，即对碳源需求的不同分析自养型和异养型微生物对污染物去除的贡献。碳源是微生物进行新陈代谢必不可少的基质之一，微生物的自养与异养特性直接决定其对碳源种类的需求及对污染物的去除效果。因此了解微生物的自养与异养特性对污水生物处理过程优势菌群的选择以及污水处理厂工艺的优化意义重大。但是，目前对于鉴定活性污泥中微生物的自养与异养特性没有明确的方法。本发明利用稳定同位素标记培养活性污泥中的微生物，定向分离得到自养菌与异养菌的DNA，从而利用分子生物学技术分别研究自养菌与异养菌的微生物特性。相比目前直接研究活性污泥中的某种特定微生物，本发明是先将活性污泥微生物分为自养与异养，进一步探究自养菌与异养菌在活性污泥中发挥的作用。
故本发明利用13C标记底物原位培养污水处理系统的活性污泥，提取培养后活性污泥的DNA，超高速密度梯度离心分离DNA，获得自养菌群与异养菌群的DNA。然后利用分子生物学技术分别测定两种菌群的微生物群落结构，分析活性污泥系统中对碳源种类需求不同的微生物在污水处理过程中的功能，未见相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可靠的污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌的鉴定方法。利用微生物对碳源的不同需求，通过投加稳定同位素标记底物培养活性污泥。根据投加碳源种类，超高速离心、分离纯化得到自养或异养菌的DNA。采用普通PCR技术，实时定量PCR技术，高通量测序技术测定分离得到的DNA样品，动态研究活性污泥系统中微生物对碳源的需求。可低成本、高效地研究活性污泥对碳源的代谢以及对生物脱氮的贡献，用于污水处理厂活性污泥系统中自养菌与异养菌的分离，指导实际污水处理厂的运行调控，具有很好的应用前景。
本发明的技术方案：
一种污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌的分离方法，其特征在于：分离自养菌时，将活性污泥混合液均分为两份，一份中加入13C标记的无机物作为实验组，另一份中加入12C标记的无机物作为对照组，分别原位培养;分离异养菌时，将活性污泥混合液均分为两份，一份中加入13C标记的有机物作为实验组，另一份中加入12C标记的有机物作为对照组，分别原位培养;提取培养后活性污泥微生物的基因组DNA;将DNA样品与氯化铯溶液混合并进行超高速密度梯度离心;采用重力法在离心管的顶部匀速注水，在离心管底部接收流出的离心液，分离得到不同密度层级的DNA溶液;用PEG6000和乙醇溶液纯化各层级的DNA样品;利用普通PCR技术、实时定量PCR技术和高通量测序技术测定分离后实验组中5-9层级的DNA样品，分析自养或异养微生物的群落特征，并与对照组进行比较;
上述用稳定性同位素标记的底物原位培养活性污泥的过程如下：
(1)取活性污泥系统的污泥混合液，用蒸馏水淘洗离心3次，将离心后的污泥定容至淘洗前体积的一半;
(2)取2个150mL锥形瓶，各加入50mL淘洗后的污泥，分别加入12C标记的底物作为对照组、13C标记的底物作为实验组;搅拌培养3个周期，每周期10小时，保持温度为25℃;前2个周期结束后淘洗离心污泥，将污泥定容至50mL后，加入对应的基质进行下一个周期的培养;
上述超高速密度梯度离心过程如下：
(1)用分光光度计测定原位培养后活性污泥微生物的基因组DNA;
(2)采用Gradient Buffer缓冲液将2.0μg的活性污泥基因组DNA定容到100μL;
(3)在15mL的离心管中，依次加入4.9mL浓度为1.85g/mL的CsCl溶液、0.9mLGradient Buffer缓冲液和步骤(2)中得到的100μL含2.0μg活性污泥DNA的溶液;
(4)采用涡旋振荡仪将上述溶液完全混合;
(5)采用折光仪测定折光率，使上述溶液的目标折射率为1.4029±0.0002，这一折射率对应的浮力密度为1.725g/mL，如果目标折射率偏大，添加Gradient Buffer缓冲液，20μL为一个添加单位;如果目标折射率偏小，添加1.85g/mL的CsCl溶液，20μL为一个添加单位;
(6)采用10mL注射器移取步骤(5)的溶液5.1mL至6mL的离心管中，密封离心管;
(7)将离心试管放入超高速离心转子，并使用螺帽将试管密封于转子中。超高速离心的基本参数是：44小时;20℃;速度45krpm或190000×g;Time：hold;Accel：9;Decel：nobreak;
(8)离心完成后，将离心后的超高速密度梯度离心管固定于三脚架上，在超高速离心管底部放置15个1.5mL离心管，用6号针头在超高速离心管底部扎一个小孔，然后在试管顶部未填充离心溶液的空隙处，将另外一个6号针头插入并把它与固定流速泵相连，随后启动固定流速泵;固定流速泵的流速设置为340μL/min;启动固定流速泵后，从离心管底部第一滴溶液流出开始计时，每隔1min更新放置于超高速离心管底部的1.5mL离心管的位置;均匀收集从超高速离心管流出的不同密度层级的DNA，得到15个不同密度层级的DNA用于后续分析;
上述各层级的DNA样品的纯化步骤如下：
(1)利用折光仪测定15层液体每层的折光率，评价分层效果;通过离心溶液密度计算的经验公式ρ=-75.9318+99.2031x-31.2551x2，推导各层液体的浮力密度，上述公式中ρ表示浮力密度，x表示折光值，使浮力密度的范围在1.690～1.760g/mL之间;
(2)每层中加入550μL的PEG6000溶液，头尾倒置若干次混匀溶液，室温静置2h或37℃加热1h，沉淀DNA;
(3)在15-20℃下13000×g高速离心30min，除去上清液;
(4)加入500μL质量百分比为70%乙醇清洗DNA沉淀，离心10min，除去上清液;
(5)再次加入500μL质量百分比为70%乙醇清洗DNA沉淀，离心10min，除去上清液;
(6)将沉淀的DNA室温干燥15min;
(7)确保DNA沉淀中无液体存在后，将其溶于30μL TE缓冲液，零下20℃保存。
本发明的有益效果
碳源是污水处理系统中微生物进行生长代谢的关键物质之一，不同处理系统中的微生物对碳源的需求有差异。为了使污水处理系统稳定运行，必须探究系统中各类微生物所需要的碳源种类，从而向各类微生物提供合适的碳源，保证其正常的生长代谢。本发明提供了一种准确性高，操作方便的污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌的分离方法，能够从基因水平上将自养菌与异养菌分离开，并借助分子生物学方法分析分离之后样品中的菌群结构。该自养菌与异养菌的分离方法可用于常规无法纯化培养菌群的分离，可用于实验室自养菌与异养菌的分析研究，指导实际污水处理厂的调控运行。
本发明分别以13C-标记无机物(或有机物)和12C-标记无机物(或有机物)为实验组碳源和对照组碳源，原位培养活性污泥，提纯培养后污泥样品的DNA，与氯化铯溶液混合，超高速离心分离并纯化DNA样品，测定分层纯化后样品的遮光率，计算得到样品的浮力密度在1.690至1.760g/mL之间，分离效果好。测定分层后的DNA样品浓度，重浮力密度层级的DNA浓度高于轻浮力密度层级。用分子生物学方法，将实验组与对照组进行比较，得到重浮力密度层级与轻浮力密度层级的样品，分析二者的菌群结构，确定所培养活性污泥中的自养菌与异养菌。本发明不改变微生物的生长环境，使原位培养并分离自养菌与异养菌成为可能，而且从基因水平上整体分离鉴定菌群结构，操作方便，具有较高的推广使用价值。
本发明的创新点
(1)本发明利用稳定同位素标记污水处理厂活性污泥中微生物的DNA，分离纯化得到自养菌与异养菌的DNA，从而可在基因水平分别研究自养菌与异养菌，确定实际污水处理厂各反应池中发挥主要作用的微生物对碳源的需求情况，丰富了活性污泥系统中微生物分子生物学研究的内容，为研究污水处理系统中代谢不同碳源的微生物提供技术支持。
(2)本发明采用活性污泥微生物原位培养方法获得不同菌种的DNA，不需要纯化培养，不改变微生物的生长环境，可大批量、整体分离污水处理厂活性污泥中的自养菌与异养菌，培养时间短、成本低、效率高。自养菌和异养菌的DNA保真性好，可用于后续分子生物学的研究，为准确获知污水处理厂各反应池中微生物对碳源的需求以及代谢污染物的功能提供有力保障。
具体实施方式
1、稳定性同位素标记底物培养活性污泥
(1)配制2种基质，分别为1号基质，含有12C-标记的碳酸钠;2号基质，含有13C-标记的碳酸钠;
(2)取活性污泥系统的污泥混合液，用蒸馏水淘洗离心三次，将离心后的污泥定容至淘洗前体积的一半;
(3)取2个150mL锥形瓶，各加入50mL淘洗后的污泥，分别加入1号基质，作为对照组;加入2号基质作为实验组，保持温度为25℃，搅拌培养3个周期，每周期10小时。前2个周期结束后淘洗离心污泥，将污泥定容至50mL后，加入对应的基质继续下一个周期的培养。
2、总DNA的提取
取培养并冷冻干燥后的活性污泥，按照DNA提取试剂盒(Fast DNA Spin kit forsoil，BIO 101system，USA)的操作说明提取基因组DNA。
3、超高速密度梯度离心DNA
将实验组与对照组的DNA进行超高速离心分离，得到不同密度层级的DNA溶液，具体操作如下：
3.1用NanoDrop ND-1000(Thermo，American)分光光度计测定培养后活性污泥微生物总DNA。
3.2采用Gradient Buffer(GB)将2.0μg的活性污泥总DNA定容到100μL。
3.3在15mL的离心管中，依次加入：4.9mLCsCl(1.85g/mL)、0.9mL GB和100μL含2.0μg活性污泥DNA的GB溶液。
3.4采用涡旋振荡仪将离心液完全混合。
3.5采用折光仪测定折光率，使超高速离心溶液的目标折射率，nD-TC为1.4029±0.0002，这一折射率对应的浮力密度为1.725g/mL，如nD-TC偏大，添加GB(20μL约为一个添加单位);如nD-TC偏小，添加CsCl(20μL约为一个添加单位)。
3.6采用10mL注射器将5.1mL的超高速离心混合液转移到6mL的离心管中，密封离心试管。
3.7将离心试管放入超高速离心转子，并使用螺帽将试管密封于转子中。超高速离心的基本参数是：44小时，20℃，速度45krpm(190000×g)，time：hold，Accel：9;Decel：nobreak。
3.8离心完成后，将离心后的超高速密度梯度离心试管固定于三脚架上，在超高速离心管底部放置15个1.5mL离心管，用6号针头在超高速离心管底部扎一个小孔，然后在试管顶部未填充离心溶液的空隙处，将另外一个6号针头插入并把它与固定流速泵相连，随后启动固定流速泵。固定流速泵的流速设置为340μL/min，启动固定流速泵后，从离心管底部第一滴溶液流出开始计时，每隔1min更新放置于超高速离心管底部1.5mL离心管的位置。均匀收集从超高速离心管流出的不同密度层级的DNA;得到15个不同密度层级的DNA用于后续分析。一般将离心液分为15层，但需多放一层，以保证第15层DNA液体体积的准确。
4、DNA纯化
4.1利用折光仪测定15层液体每层的折光率，评价分层效果。通过离心溶液密度计算的经验公式(ρ=-75.9318+99.2031x-31.2551x2，ρ表示浮力密度，x表示折光值)推导各层液体的浮力密度，使浮力密度的范围在1.690～1.760g/mL之间。
4.2每层中加入550μL的PEG6000溶液，头尾倒置若干次混匀溶液，室温静置2h或37℃加热1h沉淀DNA;
4.3在15-20℃下13000×g高速离心30min，除去上清液;
4.4加入500μL 70%乙醇清洗DNA沉淀，离心10min，除去上清液;
4.5再次加入500μL 70%乙醇清洗DNA沉淀，离心10min，除去上清液;
4.6室温干燥沉淀DNA 15min;
4.7确保DNA沉淀中无液体存在后，将其溶于30μL TE缓冲液，零下20℃保存。
分离纯化后，实验组与对照组分别得到15个不同密度层级的DNA溶液，实验组中，13C标记DNA在5-9层，既为自养微生物DNA，而对照组5-9层中没有对应的DNA层级。对照组与实验组10-14层为12C-DNA。用类似方法，以13C-有机物(实验组)和12C-有机物(对照组)为碳源培养活性污泥，可离心、分离并纯化得到异养微生物DNA。
5、13C-DNA鉴定
采用普通PCR技术，实时定量PCR技术以及高通量技术，测定实验组5-9层中的DNA样品，并与对照组进行对比，得出异养微生物或自养微生物的生物学特性。
药品与试剂
(1)Tris-HCl(1.0M，pH=8.0);
(2)Tris-EDTA[10mMTris-HCl(pH=8)，1mM EDTA(pH=8.0)];
(3)GB缓冲液[0.1MTris-HCl(pH=8.0)，0.1MKCl，1.0mM EDTA];
(4)70%乙醇;
(5)氯化铯溶液(密度为1.88～1.89mg/mL);
(6)Polyethylene Glycol 6000(PEG6000)溶液。
