申请日2014.10.27
公开(公告)日2015.01.28
IPC分类号C12N1/20
摘要
本发明公开了一种油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，具体包括以下步骤：(1)SRB富集培养基的制备;(2)SRB分离培养基的制备;(3)SRB的富集培养;(4)SRB的分离培养;(5)SRB的纯化培养，本发明具有分离纯化的速度快，从SRB富集和分离培养基的制备到纯化培养物只需要3d～5d，分离纯化的成功率高，一次分离纯化既可得到纯化培养物，操作简单、对操作人员要求较低，针对性强，本方法只适合进行SRB菌种分离纯化，因此，可广泛地应用于油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化中。
权利要求书
1.一种油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)SRB富集培养基的制备
将富集培养基溶于蒸馏水中，厌氧分装到容积为7.8ml的厌氧瓶中，每瓶分 装7ml，121℃高压蒸汽灭菌，其中，富集培养基配方为乳酸钠质量浓度0.4%～ 0.6%、硫酸亚铁铵质量浓度0.05%～0.2%、酵母浸粉质量浓度0.05%～0.1%、氯 化钠质量浓度0.5%～2.0%、氯化镁质量浓度0.01%～0.03%;
(2)SRB分离培养基的制备
将分离培养基溶于蒸馏水中，加热至充分溶解，然后厌氧分装到容积为 7.8ml的厌氧瓶中，每管7ml，121℃高压蒸汽灭菌，灭菌完后自然降温至50℃～ 55℃备用，其中，分离培养基配方为蛋白胨质量浓度0.8%～1.2%、肉浸粉质量 浓度0.9%～1.1%、乳酸钠质量浓度0.4%～0.6%、硫酸亚铁铵质量浓度0.05%～ 0.2%、酵母浸粉质量浓度0.05%～0.1%、氯化钠质量浓度0.5%～2.0%、氯化镁 质量浓度0.01%～0.03%、琼脂粉质量浓度0.8%～1.5%;
(3)SRB的富集培养
取油田污水0.2ml注入上述制备好的富集培养基中，恒温培养至培养液变黑 为止，得到富集培养物;
(4)SRB的分离培养
取0.77ml上述富集培养物用制备好的富集培养基按照10倍系列稀释法稀释 至10-4，将10-3和10-4梯度的稀释液用1ml无菌注射器取0.1ml，分别缓慢注入 至上述50℃～55℃备用的分离培养基中，混合均匀，垂直静置放置0.5h～1h得 到透明的半固体培养基，然后置于恒温培养箱中培养，培养至培养基中出现黑 点为止，得到分离培养物;
(5)SRB的纯化培养
取1管上述富集培养基，用1ml无菌注射器抽取0.2ml富集培养基，接着用 该注射器吸入分离培养物中轮廓清晰的黑点，然后注入该管富集培养基中，放 置在恒温培养箱中培养，直到培养液变黑，得到纯化培养物。
2.根据权利要求1所述的油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，其特 征在于，所述的121℃高压蒸汽灭菌，灭菌时间为20min～30min。
3.根据权利要求1或2所述的油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法， 其特征在于，所述的灭菌完后自然降温，为确保降温均匀，降温过程中缓慢滚 动厌氧管。
4.根据权利要求1或2所述的油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法， 其特征在于，所述取油田污水现场采集后进行密封处理在4℃下保藏不超过7d。
5.根据权利要求1所述的油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，其特 征在于，所述的恒温培养至培养液变黑为止，得到富集培养物，恒温培养温度 为30℃～60℃。
6.根据权利要求1或5所述的油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法， 其特征在于，所述的置于恒温培养箱中培养，培养至培养基中出现黑点为止， 得到分离培养物，恒温培养温度为30℃～60℃。
7.根据权利要求1或5所述的油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法， 其特征在于，所述的放置在恒温培养箱中培养，直到培养液变黑，得到纯化培 养物，恒温培养温度为30℃～60℃。
8.根据权利要求7所述的油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，其特 征在于，所述的放置在恒温培养箱中培养，直到培养液变黑，得到纯化培养物， 培养时间为1d～3d。
说明书
一种油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法
一、技术领域
本发明属于石油微生物技术领域，特别涉及一种油田污水中硫酸盐还原菌 的分离纯化方法。
二、背景技术
硫酸盐还原菌(SRB)是利用油田产出液中的硫酸盐或者其它氧化态硫化物 作为电子受体来异化有机物质的微生物，它将SO42-还原成H2S，进而改变油田 水质的pH值和金属的腐蚀状态，是金属腐蚀速率显著增加的重要因素，对油田 管网带来腐蚀、堵塞等诸多有害作用。
分离和纯化SRB获得纯种的SRB单菌株，可以为油田环境的菌落结构分析 以及腐蚀现状和水质情况的评价提供重要的理论依据。
现有的SRB分离纯化方法有以下三种：稀释摇管法、叠皿夹层法和Hungate 滚管法，但目前的方法存在着以下问题：(1)稀释摇管法观察和挑取菌落比较 困难，费时、费力效率低;(2)叠皿夹层法适用范围小，分离纯化的成功率低， 往往需要3次～6次重复的分离纯化才能得到相对纯化培养物;(3)Hungate滚 管对设备操作人员要求较高，操作复杂，分离纯化效果低;(4)三种方法分离 方法时间均需要10d以上。
三、发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种油田污水中硫酸盐还原菌 的分离纯化方法。该方法具有工艺简单、操作方便、材料易得、针对性强，对 操作人员及设备要求较低、经济实用、分离纯化速度快和成功率高的优点。
一种油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，其特征在于，具体包括以 下步骤：
1、SRB富集培养基的制备
将富集培养基溶于蒸馏水中，厌氧分装到容积为25ml的厌氧管中，每管分 装9ml，121℃高压蒸汽灭菌30min。
其中，富集培养基配方为乳酸钠质量浓度0.4%～0.6%、硫酸亚铁铵质量浓 度0.05%～0.2%、酵母浸粉质量浓度0.05%～0.1%、氯化钠质量浓度0.5%～2.0%、 氯化镁质量浓度0.01%～0.03%。
2、SRB分离培养基的制备
将分离培养基溶于蒸馏水中，加热至充分溶解，然后厌氧分装到容积为25ml 的厌氧管中，每管15ml，121℃高压蒸汽灭菌30min，灭菌完后自然降温至50℃～ 55℃备用。
其中，分离培养基配方为蛋白胨质量浓度0.8%～1.2%、肉浸粉质量浓度 0.9%～1.1%、乳酸钠质量浓度0.4%～0.6%、硫酸亚铁铵质量浓度0.05%～0.2%、 酵母浸粉质量浓度0.05%～0.1%、氯化钠质量浓度0.5%～2.0%、氯化镁质量浓 度0.01%～0.03%、琼脂粉质量浓度0.8%～1.5%。
3、SRB的富集培养
取油田污水1ml注入上述制备好的富集培养基中，30℃～60℃恒温培养至 培养液变黑为止，得到富集培养物。
4、SRB的分离培养
取1ml上述富集培养物用制备好的富集培养基按照10倍系列稀释法稀释至 10-4，将10-3和10-4梯度的稀释液用1ml无菌注射器取0.1ml，分别缓慢注入至 上述50℃～55℃备用的分离培养基中，混合均匀，垂直静置放置0.5h～1h得到 透明的半固体培养基，然后置于恒温培养箱中培养，培养温度为30℃～60℃， 培养至培养基中出现黑点为止，得到分离培养物。
5、SRB的纯化培养
取1管上述富集培养基，用1ml无菌注射器抽取0.2ml富集培养基，接着用 该注射器吸入分离培养物中轮廓清晰的黑点，然后注入该管富集培养基中，放 置在恒温培养箱中培养，培养温度30℃～60℃，培养1d～3d直到培养液变黑， 得到纯化培养物。
其中，所述步骤2中的灭菌完后自然降温，为确保降温均匀，降温过程中 缓慢滚动厌氧管。
所述步骤3中的油田污水，其现场采集后进行密封处理在4℃下保藏不超过 7d。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
(1)操作简单、对操作人员要求较低;
(2)针对性强，本方法只适合进行SRB菌种分离纯化;
(3)分离纯化的速度快，从SRB富集和分离培养基的制备到纯化培养物只 需要3d～5d;
(4)分离纯化的成功率高，一次分离纯化既可得到纯化培养物。
