兽用抗生素有治疗细菌性感染、 促进生长的双重作用，被广泛应用于集约化的畜禽养殖. 我国畜禽养殖中抗生素滥用现象较严重且生物体利用率不高. 据统计，约28%~100%的抗生素母体及其代谢产物随畜禽排泄物进入水体、 沉积物、 土壤等环境介质[1]. 受抗生素持续污染的水体中总抗生素含量处于ng ·L-1乃至μg ·L-1水平，底泥和土壤中总抗生素含量处于μg ·kg-1乃至mg ·kg-1水平[2, 3]. 抗生素在极其微量的剂量下就会危害人体健康、 影响生态安全. 其最大危害是诱导生成耐药细菌株，进而诱导产生可在生物间水平转移扩散的抗性基因(ARGs)，从而使人和生物在得病后丧失被抗生素治愈的能力[4]. 此外，环境介质中高浓度的抗生素残留会影响植物生长[1]; 有些抗生素的降解产物和代谢产物还可能比母体具有更大的生物毒性和生物危害性[5].
我国关于畜禽养殖排泄物的排放标准中，尚没有抗生素的规定. 然而有限的研究已经表明，畜禽养殖排泄物中抗生素含量很高. 卫丹等[6]在养猪沼液中检出了高浓度的四环素类和磺胺类抗生素，指出规模化养猪沼液中抗生素总浓度在10.1~1090 μg ·L-1之间. Luo等[7]研究发现8种兽用抗生素在养猪场和鱼塘的检出浓度在0.12~47 μg ·L-1之间，比当地污水处理厂的检出浓度高1~2个数量级. 集约化养猪业给农村水体带来了严重的抗生素污染. 闾幸等[8]报道养猪密集的乡镇河道中抗生素总浓度在65.6~467.0 ng ·L-1之间，明显高于市区河道. Kim等[9]研究发现四环素类、 磺胺类等兽用抗生素多集中暴露于重要的农业活动区域内. 废水中的抗生素可以通过生物处理技术得到高效去除[10, 11]，特别是活性污泥法与膜分离技术相结合的膜生物反应器，对抗生素有良好的去除效果[12, 13].
在生物处理系统中，吸附和生物降解都可能是废水中抗生素去除的重要途径. 目前关于废水中抗生素生物去除的报道，大多数只关注了水中抗生素的减少，并未对污泥中抗生素的含量进行分析，因此无法从物料平衡的角度解释抗生素的真正去向. 本文在既有研究报道[6, 7, 8]的基础上，针对长三角地区养猪废水和污泥中较常见的11种兽用抗生素，优化了固相萃取与高效液相色谱串联质谱联用的分析条件，SPE阶段使用替代标质控污泥中抗生素的回收率，HPLC-MS/MS分析阶段采用内标法质控复杂基质下微量污染物的检出效果. 使用该分析技术研究了膜生物反应器对抗生素的去除规律，并采用序批式摇瓶实验粗略探讨了污泥中吸附的抗生素对污泥活性的影响.
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Waters e2695型液相色谱仪、 Waters TQ Detector 型串联三重四级杆质谱仪、 Masslynx 4.0工作站(美国Waters科技公司); 十二孔固相萃取装置(美国Supelco公司); 阴离子交换柱(SAX，3 mL/200 mg，美国Thermo Fisher Scienticfic公司); 固相萃取柱(Oasis HLB，6 cc/200 mg，美国Waters科技公司); 0.7 μm GF/F玻璃纤维滤膜(英国Whatman公司); 0.22 μm 聚四氟乙烯膜PTFE(上海安谱科学仪器有限公司); TOC-VCSN分析仪(日本岛津公司); PVDF平板膜(日本三菱丽阳株式会社); BT100-2J精密蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司); JJ-1精密增力搅拌器(上海华科实验器材有限公司); 便携式DO仪(DO-31P，日本DKK-TOA公司).
11种抗生素标准品： 四环素、 金霉素、土霉素、 强力霉素、 磺胺甲 唑、 磺胺二甲嘧啶、 环丙沙星、 诺氟沙星、 恩诺沙星、 泰乐菌素、 罗红霉素购自德国 Dr. Ehrenstorfer GmbH公司; 内标物标准品西玛通购自美国Accustandard公司; 替代标标准品thiabendazole-d4、 ciprofloxacin-d8、 erythromycin-13 C-d3购自加拿大Toronto Research Chemicals公司. 甲醇、 乙腈为色谱纯，EDTA钠、 柠檬酸、 柠檬酸钠均为分析纯，乙酸钠、 葡萄糖、 硫酸铵、 磷酸一氢钾、 碳酸氢钠、 硫酸镁、 氯化铁、 氯化钙、 氯化钾、 硫酸亚铁、 硫酸锌、 硫酸铜、 钼酸钠、 氯化钴均为化学纯，实验用水为Milli-Q水.
抗生素混标液： 准确称取11种抗生素各5 mg，用甲醇定容到100 mL的棕色容量瓶中，配制成每种抗生素浓度均为50 mg ·L-1的标液. 内标液： 溶有10 mg ·L-1西玛通的甲醇溶液. 替代物混标液： 溶有4种1 mg ·L-1替代标的甲醇溶液. 上述抗生素混标液、 内标液、 替代物混标液均4℃下密封保存，1个月内使用. 提取缓冲液： 甲醇、 0.1 mol ·L-1的Na2 EDTA溶液、 柠檬酸盐缓冲液(pH=4)体积比分别为3 ∶1 ∶2.
1.2 抗生素的固相萃取
1.2.1 废水样品的固相萃取
待测废水用0.7 μm玻璃纤维滤膜过滤，量取20 mL 到1 L细口玻璃瓶中，用Milli-Q水稀释10倍以防止有机物堵塞Oasis HLB柱，再用10%盐酸调节pH=4.0. 上述液体通过活化后的Oasis HLB柱[该小柱预先顺次通入2 mL甲醇、 2 mL Milli-Q水、 2 mL盐酸水溶液(pH=4.0)，反复活化3次]，使水中抗生素在小柱上富集后，用5%甲醇溶液清洗柱子，并真空干燥10 min. 最后，用5 mL甲醇缓慢洗脱到玻璃离心管中，氮吹至0.5 mL，再加入20 μL内标液，甲醇定容到2 mL. 上述溶液经过0.22 μm PTFE针式滤器过滤，收集在2 mL棕色玻璃瓶中，4℃避光保存，2 d内完成测试.
1.2.2 污泥样品的固相萃取
污泥样品的前处理方法在文献[7, 14]的基础上优化获得，为防止污泥中含有的大量有机物堵塞SAX-HLB串联柱，减少进样污泥量. 24 h冻干污泥过150目孔筛后，准确称量0.2 g置于10 mL离心管中，添加替代标混合液200 μL. 加入5 mL提取缓冲液，涡旋混合1 min，超声15 min，3500 r ·min-1离心5 min，收集上清液. 上述提取步骤共重复3次，合并3次提取液约13~15 mL，经过0.7 μm玻璃纤维滤膜过滤后，用Milli-Q水稀释到200 mL，再用10%盐酸调节pH=4.0. 混合液通过串联的SAX-HLB小柱[该串联体系预先顺次通入2 mL甲醇、 2 mL纯水、 2 mL盐酸水溶液(pH=4.0)，反复活化3次]，使水中抗生素在小柱上富集后，拆除SAX柱. 用5%甲醇溶液清洗HLB柱，真空干燥10 min. 用5 mL甲醇缓慢洗脱到玻璃离心管中，氮吹至0.5 mL，再加入20 μL的内标液，甲醇定容到2 mL. 溶液经过0.22 μm PTFE针式滤器过滤，收集在2 mL棕色玻璃瓶中，4℃避光保存，2 d内完成测试.
1.3 LC-MS/MS分析
LC-MS/MS分析条件参照文献[8]，不过采用内标法进行检测. 内标法利用内标物与被测组分恒定的内在比例，以校准和消除由于操作条件波动而对分析结果产生的影响，从而较外标法在定量分析中更加精确. 内标物质选用与抗生素性质结构相似、 但极少在自然环境介质中检出的西玛通[15, 16]. 分别选取TBH-D4、 SAX-D4、 CFX-D8和ETM-13 C-D3作为四环素类、 磺胺类、 喹诺酮类和大环内酯类抗生素的替代标[17, 18]. 替代标与同一类抗生素性质结构相似，回收率高低通常可以指示SPE-HPLC-MS/MS测试方法的可行性及SPE样品制备的情况. 11种抗生素和5种内标、 替代标优化后的MRM模式参数如表 1所示.
表 1 16种目标物的MRM模式参数
1.4 废水和污泥的添加回收实验
嘉兴市某大型养猪场沼液，使用聚合氯化铝和聚丙烯酰胺混凝沉淀去除悬浮物. 由此获得的滤液COD浓度为(1101±216)mg ·L-1，可以代表大多数养猪场废水的有机物浓度[6]. 向滤液中添加11种抗生素的混合标准液，使每种抗生素的添加浓度为20 μg ·L-1或50 μg ·L-1. 测试添加抗生素混合标准液前后滤液中抗生素浓度的增量，与理论添加浓度的比值即计算为回收率. 20 μg ·L-1和50 μg ·L-1添加实验各平行测试3次.
取MBR中处理养猪沼液的活性污泥，离心(5 min、 3000 r ·min-1)后保留污泥相，冷冻干燥24 h，研磨过150目孔筛. 准确称取0.2 g干燥污泥样品于50 mL离心管中，添加替代标混合液200 μL. 随后，添加11种抗生素的混合液，使每种抗生素的添加浓度分别为50 μg ·kg-1和200 μg ·kg-1. 测试添加抗生素混合标准液前后污泥中抗生素浓度的增量，与理论添加浓度的比值即计算为回收率. 50 μg ·kg-1和200 μg ·kg-1添加实验各平行测试3次.
1.5 膜生物反应器处理养猪废水实验
完全混合式膜生物反应器，有效容积15 L. 内置1片PVDF平板膜(有效膜面积0.1 m2，膜孔径0.1 μm). 采用可编程逻辑控制器(PLC)控制间歇进出水和曝气过程. 每天2个运行周期，每个运行周期12 h，具体运行模式如下： 进水10 min 无曝气55 min 曝气90 min 进水4 min 无曝气45 min 曝气100 min 进水4 min 无曝气50 min 曝气95 min 进水2 min 无曝气55 min 曝气40 min 曝气、 膜过滤出水120 min. 该运行模式是为提高脱碳脱氮除磷效率而优化设计的. 进出水输送采用蠕动泵; 曝气阶段维持溶解氧浓度为0.5~2.0 mg ·L-1; 不曝气阶段增加叶轮搅拌，转速2000 r ·min-1. 使用加热棒维持水温为29~32℃.
接种污泥来自某城市污水厂，接种浓度是6300 mg ·L-1. 反应器共运行1~93 d，分为如下2个工况： 工况1(1~62 d)，HRT=7 d，SRT=62 d，进水使用养猪沼液原水，因此进水COD/TN较低，仅为0.7; 工况2(63~93 d)，HRT=5 d，SRT=93 d，为解决工况1中因碳源不足而导致的污泥浓度不增加、 污泥解体的问题，在进水中外加乙酸钠使进水COD/TN提高至2.1. 分别在第34、 54、 62、 70、 93 d取水样和污泥样品来测试抗生素浓度. 抗生素的物料平衡计算按照下述方法： 34~62 d使用的原水是同一天采集后、 拿回实验室冷藏储存的水样，实验期间水质变化不大： COD浓度为(984±231)mg ·L-1、 氨氮浓度为(831±145)mg ·L-1; 抗生素总浓度为(44.82±1.23)μg ·L-1. 此期间出水水质也变化不大： COD浓度为(481±135)mg ·L-1; 氨氮浓度为(229±74)mg ·L-1; 抗生素总浓度为(6.70±1.66)μg ·L-1. 全程无排泥操作，平均MLSS为(6.8±0.7)g ·L-1.
基于水相、 污泥相和生物降解的抗生素存在质量平衡关系[19]，按照式(1)、 (2)进行物料平衡估算，得出抗生素流入量(M流入)、 流出量(M流出)、 污泥吸附量(M污泥)、 水相积累量(M水相)和生物降解量(M降解)关系如下：
M流入-M流出=M水相+M污泥+M降解 (1)
Q·(c流入-c流出)=c水相·V+MLSS·c污泥·V·10-3+M降解 (2)
式中，M流入： 随进水流入MBR的抗生素质量，μg; M流出： 随出水流出MBR的抗生素质量，μg; M水相： 反应器上清液中积累的抗生素质量，μg; M污泥： 污泥中吸附的抗生素质量，μg; M降解： 反应器内降解的抗生素质量，μg; c流入： 进水中抗生素浓度，μg ·L-1; c流出： 出水中抗生素浓度，μg ·L-1; c水相： 上清液中抗生素浓度，μg ·L-1; c污泥： 污泥相中抗生素浓度，μg ·kg-1; Q： 反应器的总处理水量，L; V： 反应器的有效容积，L; MLSS： 反应器内污泥浓度，g ·L-1.
1.6 抗生素对污泥活性的影响实验
参照BOD5测试方法[20]配制稀释水： 取3 mL 磷酸盐缓冲浓缩液[21]、 1 mL 的22.5 g ·L-1硫酸镁溶液、 1 mL的0.25 g ·L-1氯化铁溶液和27.5 g ·L-1的1 mL氯化钙溶液，加入1 L Milli-Q水中. 配制葡萄糖配水： 600 mg ·L-1葡萄糖、 189 mg ·L-1硫酸铵、 37 mg ·L-1磷酸一氢钾、 微量营养盐[22, 23](包括： FeSO4 ·7H2O 8.5 mg ·L-1、 MgSO4 ·7H2O 85 mg ·L-1、 KCl 110 mg ·L-1、 CaCl2 ·2H2O 5 mg ·L-1、 MnSO4 ·4H2O 2 mg ·L-1、 ZnSO4 ·7H2O 0.1 mg ·L-1、 CuSO4 ·5H2O 0.1 mg ·L-1、 NaMoO4 ·2H2O 0.05 mg ·L-1、 CoCl2 ·6H2O 0.001 mg ·L-1). 该葡萄糖配水的COD、 氨氮和总磷浓度分别约为600、 40和10 mg ·L-1.
城市污水厂好氧污泥取回后空曝24 h，3000 r ·min-1离心5 min去除上清液，用稀释水洗涤1次，离心取泥饼放入盛有10 L葡萄糖配水的SBR反应器中，调整污泥MLSS为2 g ·L-1，28~30℃水浴. 运行方式： 曝气11.5 h，静置沉淀0.5 h，排水5 L，再重新注入5 L葡萄糖配水，并添加碳酸氢钠调节pH 7.0~7.5. 连续换水培养10 d后，认为驯化完成. 污泥活性测试分为3组实验： 内源呼吸组、 无抗生素对照组和抗生素实验组，分别在添加了600 mL溶液的3个1 L锥形瓶中进行，驯化污泥的初始MLSS 控制在约2 g ·L-1. 内源呼吸组是为了排除污泥解体、 吸附作用等对实验结果的影响，因此该组使用的溶液只加入了葡萄糖配水中的微量营养盐成分，不加碳氮磷成分，也不添加四环素; 无抗生素对照组是为了观察不受抗生素污染的污泥对常规水质指标的降解状况，因此该组溶液中加入葡萄糖配水，不加四环素; 抗生素实验组是为了观察受到抗生素污染的污泥对常规水质指标的降解状况，溶液中加入葡萄糖配水，并添加20 mg ·kg-1四环素. 三组锥形瓶均用双层透气纱布封口，于转速130 r ·min-1、 温度30℃的恒温水浴摇床内振摇充氧. 实验开始后每隔1 h取10 mL水样，监测TOC和氨氮的浓度减少情况.
常规水质指标COD、 氨氮分析参照标准方法[24]. TOC使用TOC-VCSN分析仪测试(日本岛津公司). MLSS依据重量法测定.
2 结果与讨论
2.1 SPE-LC-MS/MS对养猪废水和污泥中抗生素分析的适用性
抗生素标准曲线的线性范围和相关系数R2，以及废水和污泥中的添加回收率与检出下限如表 2所示. 11种抗生素在相应的浓度范围内呈现良好的线性关系，标准曲线的相关系数值R2均在0.99以上. 以产生峰对峰信噪比为3(S/N=3)计算方法检出限(LOD)，获得废水中检出限为4~71 ng ·L-1，污泥中检出限为0.4~7.1 μg ·kg-1. 养猪废水中抗生素的平均添加回收率为73.0%~105.2%，相对标准偏差为3.1%~10.2%(n=3); 在污泥中的平均添加回收率为57.4%~104.6%，相对标准偏差为1.9%~10.9%(n=3). 上述添加回收率与文献报道结果接近. Li等[25]报道白洋淀湖水和沉积物中22种磺胺类、 喹诺酮类和大环内酯类抗生素的平均加标回收率(n=3)为82.7%~121.1%和63.4%~132.2%. 王硕等[26]开展污泥中氯霉素、 大环内酯类、 喹诺酮类、 四环素类和磺胺类抗生素的加标回收实验，得出加标水平为1~250 μg ·kg-1时的平均回收率分别为40%~111%. 本研究取得的废水和污泥中抗生素检测下限也与已有报道接近. Ben等[27]指出养猪废水中9种抗生素的方法检出限为3~85 ng ·L-1. Yang等[18]报道河流底泥中14种抗生素的检出限为0.3~14.0 μg ·kg-1.
表 2 11种抗生素的线性系数、 回收率和检出限
2.2 MBR对养猪沼液中抗生素的去除效果研究
养猪废水和活性污泥中抗生素的浓度变化如表 3和表 4所示. 进水中抗生素总浓度在42.92~46.51 μg ·L-1之间. 其中，四环素类抗生素的含量最高，为29.15~33.46 μg ·L-1; 磺胺类抗生素含量次之，为7.72~9.08 μg ·L-1; 喹诺酮类抗生素含量第三，为3.11~7.76 μg ·L-1; 大环内酯类抗生素含量最少，为0.07~0.47 μg ·L-1，RTM在各次测试中均未检出.
表 3 MBR处理前后养猪废水中抗生素浓度变化
表 4 活性污泥中抗生素浓度
MBR出水抗生素总浓度为(6.94±1.50)μg ·L-1，MBR对废水中总抗生素的去除率为84.3%±3.6%. 其中，四环素类的去除率86.4%±4.2%，磺胺类的去除率95.7%±1.9%. 活性污泥上清液中无论是单个抗生素、 还是抗生素总浓度，都与MBR出水相近，表明膜截留对水中抗生素的去除没有直接作用.
污泥中抗生素总浓度在34 d为5017.4 μg ·kg-1，此后持续增加，至62 d增加至13776.7 μg ·kg-1，之后趋于稳定. 各种抗生素在污泥中的积累浓度于34~62 d间几乎都出现了不同程度的持续增高.
如表 5所示，对运行34~62 d MBR中抗生素进行物料衡算，发现废水中的总抗生素有14.8%随出水流出，其余85.2%被MBR去除，其中，通过生物分解等方式去除的占51.9%，而通过污泥吸附去除的占33.2%. 四环素的去除情况与抗生素总浓度相似，MBR对废水中四环素的去除率为87.5%，其中生物分解等去除了45%，而污泥吸附去除了42.6%. 活性污泥吸附对喹诺酮类抗生素的去除贡献也很大. MBR对废水中喹诺酮类抗生素的去除率为52.2%，其中生物分解和污泥吸附分别占了27.3%和23.6%. 活性污泥吸附对磺胺类抗生素去除几乎没有贡献，磺胺类抗生素去除率高达95.8%，几乎全部依靠生物分解. 大环内酯类抗生素浓度过低，因此不予评价.
表 5 MBR中抗生素的物料恒算
本实验发现污泥吸附和生物降解都是MBR去除抗生素的重要途径. 其中，四环素类抗生素的去除以生物降解为主，污泥吸附为次，磺胺类则主要通过生物降解去除，污泥吸附贡献极小. 这与Abegglen等[28]研究结论基本一致，该文献也报道MBR处理抗生素等微量有机物主要依靠生物转化，但是污泥吸附也发挥了重要作用. 但是，在活性污泥法(CAS)、 序批式活性污泥法(SBR)等工艺中发现四环素类抗生素的去除以污泥吸附为主，极少或者小部分被生物降解，磺胺类的去除以生物降解为主[11, 29, 30]. 这可能是由于MBR中高生物量浓度和长污泥停留时间等因素提高了抗生素等难降解有机物的去除率，同时也提高了有机物的生物降解率[31].
2.3 抗生素对污泥降解活性的影响
内源呼吸组摇瓶实验前后水相中四环素浓度为未检出和0.12 μg ·L-1，污泥中浓度为0.97 mg ·kg-1和0.90 mg ·kg-1. 无抗生素对照组摇瓶实验前后水相中四环素浓度为0.04 μg ·L-1和0.23 μg ·L-1，污泥中浓度为0.84 mg ·kg-1和1.02 mg ·kg-1. 有抗生素实验组摇瓶实验前后水相中四环素浓度为0.81 μg ·L-1和0.56 μg ·L-1，污泥中四环素浓度为17.8 mg ·kg-1和18.3 mg ·kg-1. 相比内源呼吸组和无抗生素对照组，抗生素添加组的水中和污泥中抗生素浓度显著偏高，且污泥中浓度接近连续运行MBR反应器活性污泥中达到的最大抗生素浓度.
各组活性污泥对TOC的降解曲线如图 1所示. 内源呼吸组没有投加碳源，水中TOC保持在7.0~20.7 mg ·L-1之间，主要来自活性污泥的释放和分解. 无抗生素对照组和有抗生素实验组的初始TOC浓度为 204.5 mg ·L-1，摇瓶实验开始后TOC浓度迅速下降，7 h后二者浓度与空白组接近. 受到抗生素污染的污泥与没有抗生素污染的污泥，在去除TOC方面，活性差别不大.
图 1 不同活性污泥对葡萄糖的降解曲线
图 2 不同活性污泥对氨氮的降解曲线
各组活性污泥对氨氮的降解曲线如图 2所示. 内源呼吸组没有投加氨氮，水中氨氮在0~1.8 mg ·L-1之间，主要来自活性污泥的释放和分解. 无抗生素对照组和有抗生素实验组的初始氨氮浓度分别为37.6 mg ·L-1和34.3 mg ·L-1. 摇瓶实验5 h 内两组实验的氨氮浓度均迅速下降，5 h后二者浓度稳定在10 mg ·L-1左右，不再呈现下降趋势. 由此可见，受到抗生素污染的污泥与没有抗生素污染的污泥，在去除氨氮方面活性也差别不大. Abegglen等[28]同样发现，浓度500~1000 mg ·L-1的磺胺甲 唑、 磺胺嘧啶、 罗红霉素等抗生素对污泥硝化和反硝化作用没有抑制.具体参见污水宝商城资料或http://www.dowater.com更多相关技术文档。
3 结论
优化建立了适合同步检测养猪废水和活性污泥中11种兽用抗生素的HPLC-MS/MS技术，采用内标法定量，检出限低、 灵敏度高. 将该方法用于研究MBR对猪场沼液中抗生素的去除，发现MBR对四环素和喹诺酮类抗生素的去除不但依靠生物降解，还很大程度利用了污泥吸附; 而对磺胺类抗生素的去除则基本全部依靠生物降解，污泥吸附贡献不大. 在实验范围内，受到抗生素污染的污泥在去除TOC、 氨氮方面活性似乎没有呈现明显变化.（来源及作者：浙江清华长三角研究院生态环境研究所 丁佳丽 刘锐 郑炜 陈吕军 嘉兴市环境保护监测站 余卫娟 叶朝霞）
