强化生物除磷(EBPR)是目前应用最为广泛的生物除磷工艺.该工艺利用聚磷菌(PAO)在厌氧条件下将储存于体内的聚磷酸盐(Poly-P)水解获取能量, 用以吸收水中的挥发性脂肪酸(VFA), 并以聚羟基烷酸酯(PHAs)的形式储存在细胞内; 在好氧条件下PAO以储存于细胞内的PHAs作为碳源和能源, 吸收水中的磷并将其合成为Poly-P进行细胞增殖, 最终通过排除富磷污泥达到污水除磷的目的.在EBPR系统中, 还存在与PAO代谢机制相似的聚糖菌(GAO), 在厌氧条件下GAO与PAO竞争基质(VFA), 但在好氧条件下并不摄取磷, 因此, 如何提高PAO的活性和强化其与GAO对基质的竞争能力是保证EBPR工艺稳定运行的重要内容.
有研究表明, 影响EBPR系统稳定运行的因素主要有碳源、pH、温度、DO等, 其中, 温度的影响一直存在争议.一般认为, 当温度低于20℃时, 有利于PAO的竞争, 从而提升EBPR系统的性能; 当温度高于20℃时, GAO占据竞争优势, 导致污泥中PAO的份额逐渐减少, 除磷效率逐渐降低, 甚至EBPR系统的崩溃.然而, 最新的研究表明, EBPR系统在高温条件下仍可高效除磷. Freitas等在SBR中采用短期循环(厌氧20 min, 好氧10 min, 静置1 min)实现了30℃高温条件下EBPR的稳定运行. Winkler等利用PAO颗粒污泥与GAO颗粒污泥密度的差异, 通过排除污泥床上部密度较小的GAO, 在USB反应器内富集可以适应高温的PAO, 在30℃条件下实现了较好的除磷效果. Ong等研究表明, 在28~32℃的条件下, 长期运行的EBPR反应器可以实现95%的磷的去除率, qPCR检测结果表明污泥中的PAO为Accumulibacter的亚种Clade IIF.但是目前关于温度对EBPR系统中PAO的活性以及与GAO关于基质的竞争能力的影响尚无定论, 因此需要开展相同试验条件下不同温度对PAO与GAO之间的竞争影响研究, 尤其是高温条件下对其竞争过程的具体研究显得更加重要.
为了更好地理解高温条件下EBPR系统中PAOHT的活性及基质竞争的影响, 本研究以实验室中30℃高温条件下长期运行的具有较好除磷功能的SBR反应器中的污泥为对象, 结合FISH技术, 探讨15~30℃(基于南方全年污水温度范围约为10~30℃)温度条件下高温聚磷菌(PAOHT)的释磷、吸磷以及乙酸吸收速率, 以期为温度变化幅度较大的地区和接收较高温度工业废水的生物除磷系统的稳定运行提供依据.
1 材料与方法1.1 污泥来源
试验污泥取自实验室30℃高温条件下长期运行(430 d)的SBR反应器[15].该反应器采用A/O方式运行, 每天6个周期, 每个周期为4 h, 其中, 进水7 min, 厌氧1 h, 好氧2 h, 沉淀40 min, 排水10 min, 闲置3 min.控制水力停留时间(HRT)为8 h, 污泥停留时间(SRT)为8 d.反应器温度一直维持在30℃.进水COD(乙酸)浓度为300 mg·L-1, 磷(PO43--P)浓度10 mg·L-1, 而出水磷(PO43--P)始终小于0.1 mg·L-1, 磷的去除率高达99%以上.反应器中的悬浮固体(SS)和挥发性悬浮固体(VSS)浓度分别稳定在2.36 g·L-1和1.63 g·L-1, 运行高效稳定.
1.2 活性污泥释磷吸磷速率测定
活性污泥释磷吸磷速率测定采用间歇试验法.试验装置见图 1.试验开始前, 先采用经脱氧处理的自来水对污泥进行陶洗, 然后将其倒入反应瓶中, 加入配制好的基质溶液(与SBR反应器进水水质保持一致), 反应瓶底部置有磁力转子保证完全混合状态, 反应过程中的温度利用水浴槽进行控制.在厌氧阶段, 通入氮气隔绝空气, 确保反应瓶处于厌氧状态; 在好氧阶段, 以60 L·h-1的速率通入空气, 保证混合液中的溶解氧(DO)大于2 mg·L-1.在不同反应时间点取样, 测定相应的磷及乙酸浓度, 试验结束时测定混合液的SS和VSS, 用于计算厌氧释磷速率[以P/VSS计, mg·(g·h)-1, 下同]、好氧吸磷速率[以P/VSS计, mg·(g·h)-1, 下同]和乙酸吸收速率[以HAc/VSS计, mg·(g·h)-1, 下同].
1.氮气瓶; 2.曝气机; 3.进水管; 4.取样管; 5.排气管; 6.磁力搅拌器; 7.转子; 8.反应瓶; 9.温度计; 10.水浴槽
图 1 间歇试验装置示意
1.3 分析方法
磷(PO43--P)采用钼锑抗分光光度法; 悬浮固体(SS)和挥发性悬浮固体(VSS)采用重量法; 化学需氧量(COD)采用重铬酸钾法; pH采用玻璃电极法.挥发性脂肪酸(VFAs)采用气相色谱法(型号：安捷伦6890N), 检测器为氢火焰离子(FID)检测器, 色谱柱型号为DB-FFAP.
1.4 FISH分析方法
样品预处理：取好氧末污泥混合液离去上清液, 加入1 mL的1×PBS缓冲溶液重悬, 重复操作两次后, 加入1 mL的4%的多聚甲醛溶液重悬, 置于4℃条件下固定2 h, 然后离去上清液, 加入1×PBS缓冲溶液离心, 重复3次, 以洗去多余的多聚甲醛溶液, 分别加入0.5 mL的1×PBS缓冲溶液和无水乙醇, 摇匀置于-20℃下保存.
脱水和杂交：将涂好的载玻片放置于培养箱中干燥, 干燥好的载玻片依次放于75%、95%、100%的乙醇溶液中脱水3 min, 取出后风干.将事先配好的杂交缓冲液和探针使用液以体积比8：1的比例混合, 避光, 涂于载玻片的样品上, 将载玻片迅速移回到杂交管中, 于46℃条件下杂交2~4 h, 杂交完成后取出载玻片进行洗脱处理并立即风干封片.
样品观测及分析方法：采用激光共聚焦显微镜(德国莱卡SP8) 观察样品和图像采集, 用Image-ProPlus 6.0软件对所采集的图像进行统计分析, 从而确定样品中PAO、GAO和EUB所占比例.
有关荧光探针和杂交的详细操作参见文献.
2 结果与讨论2.1 试验污泥的活性
图 2为试验污泥在30℃下的活性测定结果.该污泥在厌氧段的最大释磷速率为239.46 mg·(g·h)-1, 好氧段的最大吸磷速率为79.90 mg·(g·h)-1, 厌氧段的乙酸吸收速率为357.47 mg·(g·h)-1, 对应的吸收单位乙酸释磷量(ΔP/ΔHAc)为0.628.说明该污泥中的聚磷菌在高温下具有较好的释磷、吸磷以及对基质的吸收能力.
图 2 试验污泥30℃时厌氧释磷、乙酸吸收及好氧吸磷的变化
Brdjanovic等关于温度对生物除磷的影响性研究表明, 在30℃时其污泥最大释磷速率为68 mg·(g·h)-1, 好氧最大吸磷速率为57 mg·(g·h)-1, 乙酸吸收速率为180 mg·(g·h)-1, ΔP/ΔHAc为0.376.相较之下, 本研究的试验污泥在30℃高温条件下运行长达一年多, 有更好的释磷和吸磷能力, 属于已经适应高温的PAO, ΔP/ΔHAc的值达到了0.628, 即每吸收1 mol的乙酸, 释放0.628 mol的磷, 这也就进一步表明了PAO为试验污泥中的优势菌群, 且具有更强的基质竞争能力.
2.2 试验污泥中聚磷菌及其份额
图 3为利用目前普遍采用的PAOMIX探针对试验活性污泥的FISH检测结果.从中可见, 试验污泥中的聚磷菌属于Accumulibacter. He等采用宏基因分析对12个具有除磷功能的城市污水处理厂污泥种群结构进行测定, 结果表明Accumulibacter下存在5个亚种, 分别为clade Ⅰ、ⅡA、ⅡB、ⅡC和ⅡD, 不同的污水处理厂由于水质和运行条件不同存在着不同种属的PAO. Ong等[14]研究了高温条件下(28~32℃)以乙酸为基质的EBPR系统除磷效率, 结果表明, 即使温度高达32℃, EBPR仍获得了较好的处理效果, 利用qPCR技术分析得出, 污泥中聚磷菌的优势菌属为Accumulibacter的亚种clade IIF.而Peterson等发现Accumulibacter的不同亚种具有不同的生态生理学特性.由此说明本系统出现的适应高温的聚磷菌为Accumulibacter的亚种.
图 3 试验活性污泥中微生物的群落结构
表 1为试验活性污泥中PAOs和GAOs份额以及与Ong等结果的比较.从中可见, 试验污泥中PAO份额高达86%, 远高于Ong等培养的污泥, 说明本研究试验污泥在高温条件下具备更好的增殖和基质竞争能力.以上结果说明, 试验污泥中的优势菌为PAO, 这与活性试验结果相印证, 进一步证明了试验污泥具有较好的释磷和吸磷能力, 为温度试验奠定了良好的基础.
表 1 试验活性污泥与Ong等采用的污泥中PAOs和GAOs份额比较
2.3 温度对活性的影响
不同温度下污泥的厌氧释磷和好氧吸磷试验结果见图 4, 相应的反应速率见表 2.从数据可知, 随着温度的升高, PAOHT的厌氧释磷和好氧吸磷速率逐渐增大, 当温度为15、20、23、25、27、30℃时, 厌氧段最大释磷速率分别为76.50、95.86、150.69、150.78、171.74、239.46 mg·(g·h)-1, 好氧段最大吸磷速率分别为27.36、44.72、49.61、51.52、61.73、79.90 mg·(g·h)-1.现有研究表明, 常温PAO在温度低于20℃时, 厌氧释磷和好氧吸磷速率随温度的增加而增大, 高于20℃时, 反应速率不再随温度的增加而变化.而本研究中的高温聚磷菌(PAOHT)在15~30℃温度范围内, 活性随温度的升高而增强.
图 4 不同温度下试验污泥的厌氧释磷和好氧吸磷历时变化
表 2 不同温度下的释磷吸磷速率
在15~30℃温度范围内, PAOHT对乙酸的最大吸收速率分别为176.70、233.14、241.59、247.22、313.37、357.47 mg·(g·h)-1, 乙酸的最大吸收速率随温度的升高而增大.该试验结果与Brdjanovic等关于温度对最大乙酸利用速率的影响所得出的结论有所不同, 其认为当温度超过20℃时, PAO和GAO对乙酸的最大吸收速率不再随温度变化, 其值为常数, 并且Lopez-Vazquez等研究表明当温度为30℃时, PAO在厌氧状态下对乙酸的最大吸收速率为0.20 mol·(mol·h)-1, 而本研究的PAOHT在厌氧状态下对乙酸的最大吸收速率为0.357 g·(g·h)-1, 其中VSS(以C5H7NO2计)的摩尔质量为113 g·mol-1, 对应的碳摩尔质量为22.6 g·mol-1, 同理可得乙酸的摩尔质量为30 g·mol-1, 则对应的以碳摩尔质量计量的最大乙酸利用速率为0.269 mol·(mol·h)-1, 结果高于Lopez-Vazquez等得出的数据, 这也就说明了本系统培养的PAOHT对乙酸具有较高的吸收和竞争能力.
2.4 温度系数的确定
温度对化学反应速率常数的影响常用简化的阿伦尼乌斯公式进行描述, 具体表达式为：
式中, qi为反应速率(i=1, 2, 3, 分别代表厌氧释磷、好氧吸磷和乙酸吸收速率); qi(30)为30℃时的反应速率; T为水温(℃); θi为温度系数.
利用式(1) 对15~30℃温度范围内相应的反应速率进行拟合(图 5~6), 得出PAOHT的厌氧释磷速率、好氧吸磷速率以及乙酸吸收速率的温度系数分别为1.08、1.07和1.05. Brdjanovic等利用20℃下富集培养的除磷污泥, 对其在不同温度条件下的变化特性进行了拟合, 厌氧释磷和好氧吸磷速率的温度系数分别为1.078(5℃＜T＜20℃)和1.057(5℃＜T＜30℃). Lopez-Vazquez等对PAO的代谢研究得出, 当温度小于20℃时, 不同温度下PAO对乙酸吸收速率的温度系数为1.095.而本研究在15~30℃温度范围内, 无论是厌氧释磷、好氧吸磷还是乙酸的吸收速率, 其数值都随温度的升高而升高, 故而温度系数的确定都是以30℃为基准进行拟合的, 与前人研究得出的结果相比较, 两者数值相差较小.具体参见 图 5 不同温度下试验污泥厌氧释磷速率和好氧吸磷速率 图 6 不同温度下试验污泥乙酸吸收速率 3 结论 (1) 反应器长期在30℃高温条件下运行时, 磷的去除率高达99%以上, 此时污泥的释磷、吸磷速率分别为239.46 mg·(g·h)-1、79.90 mg·(g·h)-1, ΔP/ΔHAc为0.628, PAO占总细菌的比例高达86%±1%, 而GAO的比例仅占5%左右, 反应器运行高效稳定, 出现了适应高温的PAOHT. (2) 在15~30℃温度范围内, PAOHT的活性以其对基质的竞争能力随温度升高不断增强, 当温度为30℃时, PAOHT的最大乙酸利用速率高于前人所研究的数值, 其值约为0.269 mmol·(mmol·h)-1. (3) 利用简化的阿伦尼乌斯公式对15~30℃温度范围内PAOHT的反应速率进行拟合, 得出厌氧释磷速率、好氧吸磷速率和乙酸的吸收速率的温度系数分别为1.08、1.07和1.05.
