近来年, 随着抗生素的大量使用, 人们开始逐渐关注环境体系中的抗生素、抗性菌和抗性基因的分布及行为特点(Li et al., 2015).我国是抗生素生产与消费的大国, 抗生素的年生产量约为21×104 t, 年人均消费量是美国的10倍(佟娟等, 2012).抗生素的存在是导致细菌产生抗药性的重要原因之一, 细菌一旦产生抗药性, 又可通过基因转移的方式传播, 导致环境中抗生素抗性菌的污染逐渐严重, 从而对生态环境和人体健康造成危害(孔德勇, 2015).污水处理厂由于生活污水、医药废水、养殖废水等的排入, 使得这些污水中的抗生素抗性菌也随之进入.国内外的污水处理厂均检测出大量抗生素抗性菌的存在, 已经成为环境中抗生素抗性菌的储存库(Kim et al., 2007).但同时, 污水处理也是去除抗生素抗性菌及控制抗性传播的关键环节(Rijal et al., 2009).
目前, 国内外已经开展了较多关于污水处理厂抗生素抗性菌的调查分析, 但多集中在污水处理厂进出水中目标抗性菌的分布情况, 对于不同工艺及季节对抗性菌影响的分析较少.Munir等(2011)调研了MBR工艺(Membrane bioreactor, MBR)、传统工艺(Conventional activated sludge process, CAS)等不同工艺的出水中抗生素抗性菌的数量, 发现污水处理厂出水中仍含大量抗性菌, 且MBR工艺去除磺胺类抗性菌效果更好, 但在去除四环素抗性菌时MBR工艺和传统工艺没有显著性差异(p>0.05).相比于传统工艺, MBR工艺具有运行管理方便、占地面积少、处理水质稳定、脱氮效果优良等优点.但它对抗生素抗性菌的去除是否表现出绝对优势性, 目前还没有明确结论.另外, Yuan和Mackuak等在研究不同季节抗性菌去除效果时发现, 春、夏季污水处理厂对抗性菌的去除效果优于冬季(Mackuak et al., 2014; Yuan et al., 2014).
基于此, 本研究通过调查无锡市污水处理厂进出水中抗生素抗性菌的分布情况, 对比不同工艺及不同季节污水处理厂抗生素抗性菌的去除效果, 以了解无锡市污水处理厂抗生素抗性菌的现状, 旨在为未来城市污水处理厂的抗生素抗性菌环境风险评估和优化去除提供理论依据和技术支持.
2 实验部分(Experiments) 2.1 污水处理厂选取及样品采集
为研究MBR工艺与传统工艺在去除抗生素抗性菌效果的差异性, 本文选择位于无锡市的6座污水处理厂, 对其进出水中的抗生素抗性菌进行调查, 并依次编码为A、B、C、D、E及F厂, 各污水处理厂分别设计3个采样点(F厂为2个采样点)：1号采样点位为污水处理厂的沉砂池出水(同一个污水厂的2种水处理工艺进水水质相同), 即生化池进水;2号采样点位为MBR工艺膜池出水;3号采样点位为传统工艺出水, 其中, A厂出水为二沉池出水, E厂出水为转盘过滤器出水, 其它厂均为滤布滤池出水, 且为了减少不同消毒处理工艺带来的差异性, 所有出水未经过消毒处理.各污水处理厂情况如表 1所示.其中, MBR工艺均为AAO工艺与膜反应器的组合形式, 膜生物组件采用中空纤维膜, 膜材料为常见的聚偏氟乙烯(PVDF), 孔径大小 < 0.5 μm, 并采用抽吸泵抽吸的方式运行.膜组件的具体信息如表 2所示.
表 1(Table 1)
表 1 污水处理厂基本情况
表 2(Table 2)
表 2 膜组件信息
2015年夏季(9月和10月)进行2次样品采集, 2016年冬季(1月、2月和3月)进行3次样品采集.进出水样品各采集50 mL并储存于无菌采样瓶, 样品采集后立即于4 ℃保存, 并在48 h内稀释进行接种培养实验.
2.2 抗生素抗性菌的检测方法
抗生素按其化学结构可分为β内酰胺类、大环内酯类、四环类、氨基环醇类和喹诺酮类及其他.同时, 参考我国抗生素的使用情况和抗性菌的分布情况(李振等, 2009; Łuczkiewiczet al., 2010; 陆孙琴等, 2011), 选择氨苄霉素、红霉素、四环素、卡那霉素及环丙沙星这5种抗生素依次代表常见的5类抗生素, 从而测试无锡市污水处理厂进出水中抗生素抗性菌的分布.本研究利用传统的异养菌平板培养法来检测目标抗生素抗性菌.同时为了说明抗生素抗性菌占总异养菌的比例, 也检测了进出水中的总异养菌数量.
首先, 依据《临床和实验室标准协会》(Clinical And Laboratory Standards Institute, CLSI)中抗生素对细菌的最小抑制浓度确定目标抗生素浓度, 具体如表 3所示.
表 3(Table 3)
表 3 目标抗生素基础信息及使用浓度
其次, 利用培养基R2A agar(CM0906, OXOID, 配制浓度为18.1 g·L-1)制备抗生素培养基(Zhang et al., 2015), 具体操作为：R2A agar用蒸馏水配好后于121 ℃高压灭菌20 min, 冷却至60~70 ℃后根据表 3中抗生素的使用浓度, 加入一定量的抗生素母液(用于总异养菌计数的平板无需添加抗生素, 直接倒平板即可), 与培养基混合均匀后倒入平板中, 待冷却至室温后使用.
最后, 检测抗生素抗性菌.具体操作为：用磷酸盐缓冲液(PBS, pH=7.4) 将待测水样梯度稀释, 取50 μL接种于含抗生素的R2A琼脂平板中, 在30℃培养箱中培养24 h, 选取菌落数为30~300的平板进行计数, 细菌计数采用细菌活菌平板计数方法(沈萍, 2007).总异养菌的检测方法同抗生素抗性菌检测, 只是将接种平板更换为无抗生素平板.
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 污水处理厂进水中抗生素抗性菌的分布
如图 1所示, 5种目标抗生素抗性菌在污水处理厂进水中均可检出, 说明污水处理厂中抗生素抗性菌普遍存在.进水中总抗生素抗性菌浓度为1.01×105~2.17×105 CFU·mL-1, 各厂进水中总抗生素抗性菌含量排序为D厂>C厂>E厂>B厂>A厂>F厂, 5种抗生素抗性菌的含量排序为氨苄霉素抗性菌>红霉素抗性菌>四环素抗性菌、卡那霉素抗性菌和环丙沙星抗性菌.其中, C厂和D厂氨苄霉素抗性菌分别为1.48×105 CFU·mL-1和1.66×105 CFU·mL-1;而F厂氨苄霉素抗性菌为8.02×104 CFU·mL-1, 仅为D厂的1/2.
图 1(Fig. 1)
图 1 抗生素抗性菌在不同污水处理厂的分布情况(n=5)
本研究调查的目标污水处理厂进水中, D厂包括两家大型医院的排水, E厂进水中含有制药废水, A、B、C、F厂的进水中只包含小型社区医院的废水排放.对照图 1可知, D厂的总抗生素抗性菌数量最多, 很可能是由于进水中含有较多医院废水和工业废水导致, 医院废水中常常含有较高浓度的抗生素(Lindberg et al., 2004; Huang et al., 2011).研究认为, 在长期的抗生素驱动压力下可能诱发细菌进行选择性基因突变和基因水平转移(Heuer et al., 2007), 从而增加抗生素抗性菌的数量(Accinelli et al., 2007).E厂虽然工业废水比例较低(10%), 但由于进水中含有制药废水, 导致其抗生素抗性菌的浓度也较高.由此说明抗生素抗性细菌的含量分布与区域周边生活污水、工业废水的排放及人类活动等因素密切相关, 此观点得到Xu等(2015)认同.
另外, 本研究中氨苄霉素抗性菌是目标污水处理厂进水含量最多的抗生素抗性菌.国内的研究表明, 污水处理厂β-内酰胺类抗性菌的比例高于其他几种常检测的抗性菌.例如, Yuan等(2014)研究发现, 污水处理厂出水和活性污泥中总异养菌对头孢氨苄产生抗性的比例都超过30%, 而对庆大霉素和四环素产生抗性的比例都低于10%;陆孙琴等(2011)和Yin等(2013)发现, 污水处理厂β-内酰胺类抗性菌浓度高于四环素类抗性菌.其原因主要是氨苄霉素属于β-内酰胺类抗生素, 这类抗生素是我国医疗抗生素中最常使用的药物, 并且常被过量使用(Gao et al., 2012), 该类抗生素的大量排放会引起其抗性菌的产生.而国外的相关研究表明, 国外的污水处理厂中含量最多的抗生素抗性菌并不是氨苄霉素抗性菌.例如, Reinthaler等(2003)和Watkinson等(2007)分别发现从澳大利亚某污水处理厂废水中分离的大肠杆菌对四环素的抗性均高于50%.Galvin等(2010)对从爱尔兰地区污水处理厂中分离出的大肠杆菌进行研究发现, 氨苄霉素抗性菌占12.5%~24.5%, 四环素和环丙沙星抗性菌分别占12.4%~39.0%和0~7.5%.另外Guardabassi等(2002)对从丹麦的污水处理厂污水中分离的不动杆菌进行研究, 发现进水中对氨苄青霉素的抗性最弱.由此可知, 不同地区污水处理厂中同种抗生素抗性菌的含量区别较大, 这很可能与不同地区消费的抗生素种类不同有关.具体参见污水宝商城资料或http://www.dowater.com更多相关技术文档。
3.2 抗生素抗性菌占总异养菌的比例
污水处理厂进水中总异养菌(Heterotrophic plate count, HPC)浓度为1.413×105 ~2.749×105 CFU·mL-1, 出水中总异养菌浓度比进水低1个数量级, 浓度为0.242×105 ~0.876×105 CFU·mL-1.由表 4可知, 虽然污水处理对抗生素抗性菌有一定的去除能力, 但A厂、D厂及F厂出水中四环素抗性菌占总异养菌的比例相对于进水没有明显下降, 反而有增加趋势, 例如, A厂进水中四环素抗性菌占总异养菌的比例为2.35%, 而出水中增加至5.01%.另外, 出水中卡那霉素、环丙沙星抗性菌占总异养菌的比例相对于进水也没有明显降低.
表 4(Table 4)
表 4 不同抗生素抗性菌占总异养菌的比例
Zhang等(2009)在研究中发现, 污水处理工艺能去除1~3个数量级的不动杆菌和总异养菌, 然而出水中抗生素抗性菌的比例明显增加.同时, Figueira等(2011)发现，环丙沙星和卡那霉素占总异养菌的比例也有出水高于进水现象.其中, 关于四环素抗生素抗性菌的研究中, Kim等(2007)认为, 增强活性污泥有机负荷和减少污泥泥龄(SRT)会导致SBR工艺处理后的四环素抗性菌增多, 而且抗生素抗性菌所占比例没有明显减少.该观点被很多研究者认同, 刘冲等(2013)认为可能是由于污水处理工艺没有选择性地去除四环素抗性菌;也可能是活性污泥对四环素有较好的吸附效果造成(四环素在活性污泥上的最大吸附量为72 mg·g-1)(宋现财, 2014), 当污泥中的细菌被更多四环素包围, 将诱导出更多的四环素抗性菌或抑制其他抗性菌生长;又有可能是污泥中的四环素抗性菌随着出水排出造成, 但这还需进一步分析.
总体来看, 污水处理过程虽然可以消减抗生素抗性菌的总量, 但抗生素抗性菌的比例却有增加趋势.目标污水处理厂选择性去除抗生素抗性菌的效果不佳, 出水中仍含有大量的抗生素抗性菌, 这些抗生素抗性菌进入环境后会进一步引起水体、土壤等污染, 进而危害人类健康.
3.3 工艺对抗生素抗性菌的影响
不同工艺对抗生素抗性菌的去除效果如图 2所示, MBR工艺对氨苄霉素抗性菌、红霉素抗性菌有较好的去除效果, 去除率分别为72.00%~91.80%和83.51%~96.50%, 传统工艺对上述抗生素抗性菌的去除率分别约为72.56%~88.20%和74.48%~93.92%.但MBR工艺对四环素、卡那霉素和环丙沙星抗性菌的去除率没有明显优势.
图 2(Fig. 2)
图 2 不同工艺的抗生素抗性菌去除效果(n=5)
由图 2还可知, 污水处理厂中MBR工艺和传统工艺对抗生素抗性菌的去除率都比较高, 尤其是对氨苄霉素和红霉素抗性菌的去除率最高.研究其化学结构可知, β-内酰胺类和大环类脂类分别含有酰胺键和酯键等易水解的敏感化学键(邵一如等, 2013), 抗生素抗性菌含有消除这些脆弱化学键的酶而摧毁这些抗生素的活性, 从而减少抗生素抗性菌的含量.针对不同的抗生素抗性菌, 不同的处理工艺其处理抗生素抗性菌的效果也有所不同.本研究发现, MBR工艺对氨苄霉素抗性菌的去除效率普遍高于传统工艺.主要原因有:MBR膜池MLSS浓度较高, 为了保持较高的传氧速率需要加大曝气强度, 有利于污泥微生物分解抗生素, 从而强化抗生素抗性菌的去除(刘阳等, 2008); MBR膜反应器的膜孔径均不超过0.5 μm, 在兼顾传统活性污泥的吸附作用的基础上强化了物理拦截作用;MBR膜反应器的水力停留时间和污泥停留时间分离, 能够更好地实现抗生素的降解和吸附, 提高污水处理工艺对抗生素的去除率, 进而改善抗生素抗性菌的去除率(Kim et al., 2005).这一结果也被其他学者所证实, Choi等研究发现, MBR工艺对氨苄霉素抗性菌的去除率(高于90%)高于传统工艺, 并且随着污泥停留时间(SRT)的延长去除效果逐渐升高(Choi et al., 2007; Xia et al., 2012);Munir等(2011)在研究MBR工艺和传统工艺对抗生素抗性菌的去除效果时发现, 传统工艺对四环素抗性菌的去除效果高于MBR工艺.产生这种现象的原因可能是MBR工艺的生化池污泥浓度比传统工艺高, 而活性污泥对四环素有良好的吸附性能, 从而导致MBR工艺中由于抗生素压力或者基因转移产生更多的四环素抗性菌.其次, 部分研究认为, MBR工艺去除难降解有机物如抗生素等更依赖于化合物自身结构, 如苯环个数和所含氯的数量等(韩磊等, 2009).
总体来说, 通过比较MBR工艺和传统工艺对污水处理厂抗生素抗性菌的去除率, 发现不同工艺对不同抗生素抗性菌去除优势性不同.其中, MBR工艺去除氨苄霉素抗性菌和红霉素抗性菌有一定优势性, 而去除四环素、卡那霉素和环丙沙星抗性菌的优势不明显.
3.4 季节对抗生素抗性菌的影响
冬、夏季6个污水处理厂对5种抗生素抗性菌的去除量如表 5所示.由表 5可知, 在所调研的6个污水处理厂中, 总异养菌和多数抗生素抗性菌的夏季去除量均高于冬季去除量, 并且大部分没有表现出冬、夏季的显著性差异(p>0.05), 只有环丙沙星抗性菌表现出冬、夏季的显著性差异(p < 0.05), 其中, 夏季环丙沙星抗性菌的去除量为1.525×103~7.12×103 CFU·mL-1, 冬季环丙沙星抗性菌的去除量为0.9×103~5.25× 103 CFU·mL-1.
表 5(Table 5)
表 5 不同季节抗生素抗性菌的去除量
对于总异养菌和抗生素抗性菌的夏季去除量高于冬季去除量的现象, 可能是由微生物生长的最佳温度导致, 夏季温度较高时微生物活性增强, 难降解有机物(如抗生素类)在较高温时更容易被降解.Yuan等(2014)也认为春、夏季抗生素抗性菌多于冬季, 其中, 环丙沙星去除量有明显的季节差异(p < 0.05).环丙沙星主要用于治疗敏感菌引起的呼吸道感染、胃肠道感染、伤寒等疾病, 而冬季属于流行性感冒等疾病多发季节, 所以环丙沙星等抗生素的使用也随之增加并表现出显著季节差异性.Mackuak等(2014)也研究发现，环丙沙星抗生素有明显的季节差异性.由此看来, 污水处理厂中抗生素抗性菌的变化与抗生素的使用量关系密切.因此, 为减少环境中抗生素抗性菌的数量, 应该严格控制抗生素的使用.
4 结论(Conclusions)
1)5种抗生素抗性菌在无锡市6座污水处理厂进出水中均可检出, 且抗生素抗性菌浓度与各污水处理厂的工业废水和医药废水比例呈正比.进水中浓度为103~105 CFU·mL-1, 出水浓度比进水低1~2个数量级, 且氨苄霉素抗性菌数量最多, 占总异养菌的比例超过50%.同时, 部分污水处理厂出水中抗性菌占总异养菌的比例相对于进水有增加趋势.
2) 对比MBR工艺和传统工艺对抗性菌的去除率, 发现不同工艺对不同抗生素抗性菌去除优势不同.MBR工艺对去除氨苄霉素和红霉素抗性菌表现出一定优势, 而MBR工艺对去除四环素、卡那霉素和环丙沙星没有表现出一定的优势性.
3) 通过比较不同季节对抗性菌去除量的影响, 发现夏季抗性菌的去除量略多于冬季, 且只有环丙沙星抗性菌的去除量表现出显著的季节性差异(p < 0.05).
