生物法一直是工业有机废水处理重点研究的领域, 是处理有机废水最常用、最经济的方法之一, 随着微生物检测技术的不断发展, 高通量测序技术的成熟与普及, 近几年, 探究有机污染物的降解效率与微生物间的联系、微生物群落结构及功能和废水处理的相关性成为研究的热点.有研究表明, 微生物群落具有很高的敏感性以及对多变环境的适应性, 群落结构在不同的废水处理系统以及在同一废水处理系统的不同运行时期、不同的运行工艺中都表现着差异, 环境参数改变时, 细菌群落的多样性也会随之变化.
焦化废水中含有有毒/难降解物, 成分复杂, 可生化性较差, 被世界公认为目前最难治理的工业废水, 如何提高焦化废水的可生化性, 提高焦化废水处理系统微生物的稳定性和降解效率, 一直是领域中的难点.过去的十年间, 焦化废水处理工艺大部分采用A/O、A/H/O或者A/O2等先经过厌氧过程再到好氧过程的处理方法.相对于厌氧过程, 好氧过程有机物的分解比较彻底, 释放的能量多, 有机物转化速率快, 废水能在较短的停留时间内获得高的COD去除率.近几年, 焦化废水处理也开始直接从好氧阶段开始, 形成了新的好氧-水解-好氧的新工艺.
在实际工程运行的启动阶段, 生物系统的微生物需要通过其他废水处理工程提供大量的污泥进行培养, 因为市政污水处理厂污泥的生成量大, 相对容易获取, 大部分焦化废水处理工程的启动阶段都要部分或者全部接种市政污泥.李秀艳将市政污泥接种于焦化废水中, 经过32 d的驯化使活性污泥对焦化废水中酚和COD的去除率分别为99.8%及60.0%,; 笔者的团队曾经设计了新建的4个焦化废水处理工程, 全部采用市政污泥调试运行成功.目前对于焦化污泥驯化的研究大多只关注驯化后污泥对废水的降解能力, 没有涉及到微生物菌落的结构分析, 深入研究微生物群落的变化才能从本质上揭示整过驯化过程活性污泥降解性能改变的原因, 指导工程的调试与运行.本研究采集焦化废水原水置于好氧反应罐中, 接种市政污泥, 检测好氧降解过程中废水成分的变化, 采用Illumina高通量测序平台从种群和群落水平分析微生物群落的进化和演替过程, 讨论环境因子和微生物菌群间竞争分别的作用机制.本研究工作的结果可以指导实际工程进水水质条件、工艺设计参数确定以及优化运行的决策.
1 材料与方法 1.1 焦化废水与市政污泥的采集
实验所用的焦化废水(原水)采自宝钢集团广东韶关钢铁焦化厂酚氰废水处理站隔油池进水口, 焦化废水主要污染指标为COD 3857.26 mg·L-1、氨氮43.23 mg·L-1、硫氰化物480.25 mg·L-1、氰化物17.28 mg·L-1、挥发酚691.45 mg·L-1、pH=9.87.实验所用的市政污泥采自广州市沥滘城市污水处理厂二沉池, 采集到的市政污泥先用尼龙纱网去除泥水混合物内的砂石等物质.
1.2 反应体系的构建及运行参数
实验装置如图 1所示.
图 1 搅拌反应釜示意
用1 mg·L-1盐酸溶液将焦化废水的pH调节至7.往反应器中加入适量处理后的焦化废水, 将市政污泥接种于反应器中, 使泥水混合物的总体积为4 L(反应器总体积为5 L), 污泥的接种量为反应体系体积的20%, 实际测得接种污泥SV=21.0%、SVI=37.3 mL·g、MLSS=5 634.0 mg·L-1、MLVSS=3 562.0 mg·L-1、MLSS/MLVSS=0.63.投加0.25 g·L-1 K2HPO4作为磷源.反应器运行的温度为30℃、pH控制在7~7.5、DO控制在2~5 mg·L-1.反应过程中不添加任何辅助碳源, 共运行144 h.
1.3 主要指标的检测方法
1.3.1 运行参数及污染物浓度的检测
驯化过程中每间隔8 h对反应体系中的COD、苯酚、氨氮和硫氰化物的浓度进行测定, 以此来初步观察污泥中微生物对废水的适应状态.其中, COD采用重铬酸钾微波消解法测定、苯酚采用液相色谱法测定、氨氮采用纳氏试剂比色法法测定、硫氰化物采用铁离子显色分光光度法测定.用电极法测定运行过程中的pH和DO.用重量法测定MLSS.
1.3.2 微生物群落结构检测
实验使用Ezup柱式土壤基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)提取污泥样品DNA.称取200 mg污泥样品, 通过Buffer SCL裂解污泥样品, 释放出基因组DNA, 然后通过Buffer SP和氯仿去除蛋白质等杂质, Buffer SB去除样品中腐殖酸, 避免对后续实验的干扰.最后将所得DNA溶液置于-20℃保存, 用于后续实验.
将上一步提取的样品DNA进行PCR扩增, 扩增后的DNA样品用1.5%琼脂糖凝胶进行检测, 以确定污泥样品的DNA是否被提取出来.实验所使用的通用引物为341f-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCG GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAG GCAGCAG-3′)和534r(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′). PCR体系的组成为：25 μL的Taq PCR Master Mix、2 μL的DNA模板、2 μL的Primer 357f-GC、2 μL的Primer 518r、19 μL的Nuclease-free ddH2O, 共50 μL的体系. PCR扩增的条件为94℃预变性4 min, 94℃变性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 32个循环, 72℃最终延伸10 min, 最后温度降至4℃保存.
将经过检测的样品DNA送至广州美格生物科技有限公司, 用Illumina高通量测序平台进行微生物群落组成和多样性检测, 将驯化过程微生物群落的演变与污染物浓度变化建立对应分析.
2 结果与讨论 2.1 污泥对焦化废水的降解
投加市政污泥后, 反应器中焦化废水的COD、苯酚、硫氰化物和氨氮浓度随时间的变化分别如图 2及图 3所示.
图 2 COD和苯酚随时间的变化趋势
图 3 氨氮和硫氰化物随时间的变化趋势
该反应器中焦化废水主要污染物质的起始浓度为COD 3 432.20 mg·L-1、苯酚469.04 mg·L-1、硫氰化物450.00 mg·L-1、氨氮41.10 mg·L-1, 经过144 h的反应后各物质的浓度变为COD 376.06 mg·L-1、苯酚0.36 mg·L-1、氨氮203.66 mg·L-1, 硫氰化物在反应96 h时其浓度已低于检测下限(0.1 mg·L-1).这次反应中, COD的去除率为89.04%, 其中苯酚、硫氰化物的去除率更是高达99.92%、100%.由此可见, 市政污泥能在较短的时间内适应焦化废水的剧毒环境, 并迅速降解废水中苯酚、硫氰化物等污染物质.
从图 2可以看出, 污泥对焦化废水有一定的适应时间, 16 h前, COD、苯酚、硫氰化物和氨氮的浓度变化都不大, 16 h后, COD开始出现大幅度的降解, 24 h前降解了20.99%, 苯酚则在24 h仍然没有变化, 24~40 h之间有一个很明显的快速降解, 40 h苯酚已经降解了97.14%, 这个时候的COD降解和苯酚的降解趋势相近, COD降解了58.95%.从图 3可知, 硫氰化物和氨氮在72 h前的变化很小, 在72 h后硫氰化物开始迅速降解, 96 h时硫氰化物的浓度已经低于检测限, 氨氮浓度则在72 h和96 h之间有较大上升, 随后趋于稳定.
反应前16 h废水的COD浓度并没有出现较大的变化, 而且刚投加的市政污泥中微生物大多为异养型, 由此可推断, 在这段时间内微生物群落还没完全适应焦化废水的环境, 无法利用废水中的大部分碳源.经过16 h的适应期, 市政污泥内的微生物群落对COD的利用率逐渐增加, 但此时苯酚浓度仍然没有变化, 说明此时的COD降低是微生物降解苯酚以外的污染物引起, 在24 h时苯酚的浓度也开始下降, 可初步推测在此实验中污泥对苯酚的适应期是24 h, 反应器运行了72 h, 硫氰化物浓度才开始出现明显的下降, 由于硫氰化物对污泥中部分微生物具有毒性抑制, 适应时间比较长, 此时COD和苯酚的浓度分别为1 144.06 mg·L-1和1.96 mg·L-1, 表明硫氰化物的降解是以苯酚基本被利用完作为条件.潘霞霞等研究了反应体系中苯酚浓度对硫氰化物降解的影响, 发现随着苯酚浓度的增大, 硫氰化物被完全降解的时间增长, 证明了上述观点.另外, 氨氮浓度随着硫氰化物的降解开始显著地升高, 理解为废水中的氰化物、硫氰化物和有机氮等物质被氧化后释放出氨氮, 表现出明显的氨化过程特征.
2.2 污泥中微生物群落结构的变化
市政污泥在焦化废水的环境中驯化, 其微生物菌落结构会发生相应的变化从而适应新的废水环境.通过Illumina高通量测序对污泥中微生物菌落进行初步分析.其中A、B、C、D、E、F分别表示培养时间为0、16、40、72、96、144 h的活性污泥样品.
从表 1中样品的序列组成及OTU组成可知, 市政污泥投入焦化废水中后, 运行16 h的污泥样品序列和OTU组成从31 985、8 070下降至28 304、7 225, 说明焦化废水对市政污泥的微生物群落表现出一定的毒性, 培养起始阶段部分微生物死亡, DNA溶解.从表 2的Shannon指数和Simpson指数可知, 0 h和16 h的数值相差很小, 说明微生物群落多样性几乎没有变化. 40 h的Shannon指数和Simpson指数有所下降, 即此时微生物多样性比0 h和16 h略低. 72 h的OTU数、Shannon指数和Simpson指数又有所提升, 表明污泥在适应焦化废水后, 微生物利用焦化废水的污染物为营养物质生长, 造成序列数、OTU数比40 h时提高了, 同时Shannon指数和Simpson指数也同样升高, 多样性回复到0 h及16 h的水平.随后的96 h, 污泥虽然适应了焦化废水的环境, 焦化废水中的大部分碳源已被利用, 微生物处在缺营养状态, 氨氮的浓度快速上升, C/N比严重失衡, 高的氨氮浓度也会抑制微生物的生长, 部分微生物因不适应此环境而死亡, 故此时的序列数、OTU数开始下降, 微生物多样性指数有较明显的降低.如图 4所示, 样品的PCoA分析图中两个物种在坐标轴之间的距离越近, 表示两个样品的物种组成越相似, 从中可知：A和B组成相似, C和D组成相似, E和F组成相似, 这3组间的组成差异大, 与该3个时间段相对应的废水污染物的组成成分也存在较大的差异, 表明微生物群落的结构变化是随着废水成分的改变及污染物成分的降解而相应改变.
表 1 各样品所含OTU数及序列分析
表 2 各阶段泥样α多样性参数结果统计
图 4 样品的PCoA(weighted unifrac)分析
面对新环境带来的冲击, 活性污泥中的微生物通过群落的演变与更替来逐步适应.从图 5中可知, 活性污泥在整个反应过程中其微生物群落90%以上是由6种phylum水平的菌群构成, 分别是Firmicutes、Verrucomicrobia、Actinobacteria、Planctomycetes、Chloroflexi、Acidobacteria、Bacteroidetes、Proteobacteria, 其中Proteobacteria及Bacteroidetes占主导地位, 丰度分别为53.52%及38.57%(表 3), 与文献的研究结果相似.整个反应过程中菌群在门水平上没有很大的变化, 但是活性污泥中的优势菌属随着废水环境的改变而更替.从图 6的污泥微生物群落的genus水平可以观察到, 起始时污泥中的优势菌属为Dechloromonas、Thermomonas, 相对丰度分别为6.04%、4.73%(表 4); 在144 h的反应过程中, 其优势菌属在不断地变化, 先是演变为Acinetobacter、Pseudomonas, 相对丰度分别为7.67%、5.37%;然后演变为Brevundimonas、Sphingobacterium, 相对丰度分别为4.16%、7.19%;最后演变为Fluviicola、Stenotrophomonas、Thiobacillus, 相对丰度分别为9.88%、4.46%、8.11%.可见, 在不断变化的废水环境中, 微生物群落会受到不同程度的冲击, 群落中的优势菌群发生变化, 活性污泥适应新的废水环境并有效利用废水中的残余物质, 存在某种作用使降解与菌群之间建立了响应关系.
图 5 phylum水平各样品相对丰度分布
表 3 微生物菌落结构门水平上的组成
图 6 genus水平各样品相对丰度分布
表 4 微生物菌落结构属水平上的组成
2.3 污染物降解与微生物群落演变的联系
结合4种环境因子的降解情况发现, 反应器运行在16~40 h之间, COD的浓度从3 135.59 mg·L-1降至1 408.90 mg·L-1, 苯酚浓度从469.04 mg·L-1降至13.42 mg·L-1, 与此同时, 污泥样品则是从样品B演变到了样品C; 再结合genus水平物种相对丰度热图的分析, 又可发现, 经过了40 h的反应, Acinetobacter、Pseudomonas两种菌属的丰度明显增大; 从表 4中可知, Acinetobacter和Pseudomonas的相对丰度分别从开始的时的0.64%、0.27%增加到7.67%、5.37%, Acinetobacter和Pseudomonas是两种较为常见的酚类降解菌, 能降解焦化废水中苯酚和间甲酚等结构较为简单的酚类物质.上述现象均表明了演变的存在.
反应器运行在72~96 h之间, 硫氰化物的浓度从450.00 mg·L-1降至0.1 mg·L-1以下, 氨氮浓度从41.10 mg·L-1升至178.01 mg·L-1, 此阶段是SCN-的降解阶段及氨氮的积累阶段.从图 7可以看出, 从72~96 h, T78、WCHB1-05、Sphingobacterium、Longilinea、Brevundimonas、Lysobacter、Phenylobacterium、Chryseobacterium、Luteimonas等菌属的丰度明显增大.从表 4可以看出, 其中的Sphingobacterium、Brevundimonas、Lysobacter、Chryseobacterium增长最多, 所占的丰度最大, 分别从72 h的0.31%、0.86%、0.90%、0.24%增加到96 h时的7.19%、4.16%、3.22%、2.16%, 说明这几种菌属参与了硫氰化物的利用. Sphingobacterium、Brevundimonas菌属也可以利用复杂的烃类物质作为碳源, 如喹啉、菲等焦化废水常见的难降解有机物.黄会静的研究表明Chryseobacterium为焦化废水中可高效降解硫氰化物的菌属, 即菌种丰度的变化受污染物或营养成分的诱导.
图 7 genus水平的前30个物种相对丰度热图
随着苯酚、硫氰化物等主要能量物质的用尽, 废水中的微生物结构也随之变化, 到144 h的测试发现, 优势菌属变为Fluviicola、Stenotrophomonas及Thiobacillus, 丰度从96 h的0.55%、2.88%、0.42%增长为9.88%、4.46%、8.11%. Thiobacillus是硫化细菌, 氧化还原态硫化物或单质硫为硫酸, 表现为专性化能自养.硫氰化物在降解的过程中会生成NH3、NO2-和S2-等代谢产物, Thiobacillus利用这些代谢产物繁殖并成为主要菌属. Stenotrophomonas、Fluviicola分别属于变形菌门的γ-Proteobacteria纲、拟杆菌门的Flavobacteria纲, γ-Proteobacteria和Flavobacteria普遍存在于含硝态氮的废水中且γ-Proteobacteria纲和Flavobacteria纲的菌属对硝态氮具有较好的利用能力.
从测序结果可知, 整个反应过程硝化细菌和亚硝化细菌没有占到优势, 在各种相对丰度热图(图 7)中没有被统计出来, 图 3的实验结果也反映了体系中的氨氮浓度没有下降.在反应的起始阶段, 焦化废水对市政污泥中的微生物具有较强的毒性抑制, 如氰化物对硝化细菌的强的抑制作用存在, 同时起始时的氨氮浓度较低, 使得硝化细菌在培养起始阶段无法快速繁殖.到了反应的中后期, 虽然氨氮浓度较高, 但此时废水中的碳/氮比较小, 在后期, Thiobacillus成为优势菌, 氧化硫为硫酸, 反应液的pH值下降, 而硝化菌适合在弱碱性的环境中生长, 解析了本实验的中后期, 在没有调节碳/氮比和pH的情况下, 硝化细菌和亚硝化细菌不能快速繁殖的现象.
从上述的结果及分析可知, 污染物成分和浓度的变化直接改变污泥中微生物所处的生存环境, 从而使得污泥中各个菌群的竞争力发生改变, 高浓度污染物质会促进适应该环境的降解菌生长繁殖, 这些菌群逐渐成为污泥微生物群落中的优势菌群.废水浓度变化带来的环境改变可以促进活性污泥不同优势菌群的构建, 即发生了微生物群落的演变.
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(1) 接种的市政污泥在克服焦化废水毒性抑制并适应环境之后, 能够有效降解废水中的污染物质, 其中40 h时降解97.14%的苯酚, 96 h时的硫氰化物浓度已低于检测限.
(2) 从苯酚降解到硫氰化物降解的不同阶段中, 优势菌群从Acinetobacter、Pseudomonas逐渐转变为Sphingobacterium、Brevundimonas, Lysobacter及Chryseobacterium, 表明存在微生物群落演替受废水组成的诱导作用, 其响应还涉及废水的环境条件如pH值等.
(3) 在焦化废水处理工程的调试及微生物驯化过程中, 客观存在基于废水环境的改变促使微生物菌群间的竞争关系加以适应, 从而导致污泥中优势菌群的演变, 通过认识环境因子和微生物菌群间竞争对群落结构演变影响的规律, 可以成为工程启动运行和稳态管理的科学工具.
