1 引言(Introduction)
石油污染对生态环境造成的危害日益严重, 采用物理或化学手段可有效降低石油污染, 但存在二次污染及治理成本高、条件苛刻等缺点, 生物降解法具有条件温和、环境影响小、适应性广等优点, 是治理石油污染有效方法之一.已报道能降解石油的微生物包括细菌、放线菌、霉菌、酵母及藻类.其中以细菌种类最多, 主要有假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、棒状杆菌属(Corynebacterium).不同环境来源微生物特性差别较大, 对石油组分降解能力及降解途径不同, 我国大部分油田开采及运输区冬季冰期较长、平均气温低, 微生物处理效果受温度等条件影响大, 寻找耐高盐、酸碱等极端环境微生物具有重要意义.
本文从我国西部石油污染土壤中筛选了一株适应性强、降解能力高的石油降解菌株, 进行了生理生化及16S rDNA序列分析, 并对菌株生长及降解特性进行研究.将该菌添加到活性污泥中, 采用SBR间歇式活性污泥法处理含油废水效果良好，为极端环境下微生物治理石油污染及含油废水处理提供科学依据.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 样品及培养基
污染土样取自于甘肃金川公司周边石油污染土壤, 原油样品来自于中石油兰州石化公司.
LB培养基：蛋白胨5.0 g;酵母粉2.5 g;NaCl 5.0 g;琼脂10.0 g;pH 7.0;蒸馏水500 mL.
基础培养基：NH4NO3 3.0 g;K2HPO4 1.5 g;KH2PO4 1.5 g;NaCl 0.5 g;MgSO4·7H2O 0.1 g;FeCl2 0.01 g;CaCl2 0.01 g;pH 7.0;蒸馏水1000 mL.
2.2 试剂及仪器
Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Maker 2000、细菌基因组DNA提取试剂盒(均来自上海生工生物工程股份有限公司), Agarose(TaKaRa Biotechnology), 十七碳酸甲酯(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司), 石油醚(天津市富宇精细化工有限公司).
TRACE DSQ GC-MS联用仪(美国赛默飞世尔科技有限公司), UV-2102PC紫外可见分光光度仪(尤尼柯上海仪器有限公司), Tanon-3500凝胶图像处理系统、EPS-300电泳仪(上海天能科技有限公司), TC-96/G/H PCR扩增仪(杭州博日科技有限公司), 5B-3B(V8)水质测定仪(兰州连华环保科技有限公司).
2.3 石油降解菌的筛选及鉴定
取10 g石油污染土样加入100 mL无菌水中, 于30 ℃、150 r·min-1振荡培养24 h.取上层液体2 mL, 加入到100 mL以原油为唯一碳源的基础培养基驯化培养, 原油浓度逐级递增为1000, 2000, 3000, 4000 mg·L-1, 每次驯化周期为3 d.取末次驯化培养液, 以10-1、10-3、10-5倍稀释, 在LB培养基上涂板, 分离优势菌, 于-80 ℃保藏备用.已分离菌株再转接到原油浓度为3000 mg·L-1的基础培养基中, 于30 ℃、150 r·min-1培养7 d, 测定石油降解率, 最后选取1株适应能力强、高效利用石油菌株JC-106.细菌形态观察、革兰氏染色、生理生化鉴定参照文献进行.
用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取细菌总DNA, 采用16S rDNA通用引物(27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGCTC AG-3′;1492R：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)扩增目的片段, 反应循环参数如下：94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性50 s, 58 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2 min, 30个循环, 72 ℃延伸10 min.PCR产物送上海生工生物工程公司测序, 在NCBI基因库中进行BLAST比对, 通过CLASTAL X和MEGA4.0软件构建系统发育树.
2.4 石油降解菌生长特性
菌株JC-106按1%接种量(V/V)接入LB液体培养基, 分别于5、15、25、30、35、40、45、55 ℃, 150 r·min-1振荡培养24 h, 测定各培养液OD600 nm, 确定菌株的最适生长温度.选择初始pH分别为2、4、6、7、8、10、12, 盐度分别为0%、1%、2%、3%、4%、5%, 于35 ℃、150 r·min-1条件下培养24 h, 测定各培养液的OD600 nm, 确定菌株的最适生长pH和盐度.
取JC-106菌液2 mL转接到原油浓度为3000 mg·L-1基础培养基, 分别在15、35 ℃条件下振荡培养, 在1、3、5、7、10、15、20 d对进行取样涂平板计数, 计算菌株在原油培养基中生长数量.
2.5 石油降解率测定
将菌株JC-106接种于含3000 mg·L-1原油基础培养基中, 分别于15、35 ℃, 150 r·min-1振荡培养15 d, 试验设3组平行、3组空白.重量法测定石油降解率, 即以石油醚为萃取溶剂, 对残余原油进行反复萃取回收, 萃取液用干燥无水硫酸钠过滤到烧杯中, 自然干燥并称重.石油降解率(η)按(1)式计算：
式中, M1为对照组石油质量(g), M2为样品组石油质量(g).
用正己烷萃取培养液中剩余原油, 过滤掉残余菌体和杂质, 定容到100 mL容量瓶中.以十七烷碳酸甲酯作为内标物(IS), 用GC-MS对石油烷烃组分进行分析, 用内标法测定残余石油中烷烃组分含量.GC-MS运行条件：DB-5MS毛细管柱30 m × 0.25 mm × 0.25 μm;采用程序升温, 柱温50 ℃, 维持3 min后以15 ℃·min-1的速率升到120 ℃, 再以8 ℃·min-1升温速率升到260 ℃, 保持25 min.载气氦气, 柱流量1 mL·min-1, 分流比20:1.进样口温度250 ℃, 传输线温度260 ℃, 进样量1 μL, 离子源温度250 ℃, EI源, 电离电压70 eV;扫描范围35~650 amu.
2.6 菌株在不同有机碳源中生长特性
将菌株JC-106接到不同浓度十二烷、二十四烷、正庚烷、正辛烷、正癸烷、环己烷、苯、甲苯、二甲苯、联苯、邻苯二酚、芘、萘、蒽、菲为唯一碳源的基础培养基, 于35 ℃、150 r·min-1培养7 d, 取样计数, 计算菌株在不同有机碳源中生长数量.
2.7 石油降解菌对含油废水的处理
从兰州市某污水处理厂生物曝气池取一定量活性污泥对其进行5 d驯化培养, 按泥水比为1:3的比例, 取活性污泥2.3 L、水6.9 L加入圆柱形生物反应器中(h=80 cm、d内=14 cm、σ=0.5 cm、V有效=12.3 L).以葡萄糖(700 mg·L-1)、氯化铵(120 mg·L-1)、磷酸二氢钾(7 mg·L-1)为进水营养物质, 进水各指标浓度为COD：656.9 mg·L-1;NH4+-N：48.74 mg·L-1;TP：1.232 mg·L-1;原油：1000 mg·L-1.室温为26~34 ℃, 1 d运行两个周期, 曝气10 h, 停留2 h, 在装置停止运行期间加营养换水.以2%(V/V)接种量接JC-106菌液于反应器中作为实验组, 以不加JC-106菌液反应器为空白对照组.分别于1、3、5、7、10、12、15 d取样, 测定出水COD、NH4+-N、TP、原油浓度, 计算各指标去除率.实验组反应器中JC-106菌株进行分离、鉴定, 计算JC-106在反应器中数量.
3 结果(Results)3.1 石油降解菌筛选和鉴定
从西部石油污染土壤分离到具有高效石油降解能力的优势菌株JC-106, 菌落呈桔红色, 圆形不透明, 表面光滑, 边缘规整, 细胞为球杆状, 细菌16S rDNA与赤红球菌(Rhodococcus rubber, NR_118602.1)序列相似性为100%, 菌株在GenBank中序列登录号为KT247409, 在系统发育树上与其聚类(图 1), 初步确定JC-106为赤红球菌(Rhodococcus rubber).
表 1 菌株JC-106生理生化特征
图 1菌株JC-106的系统发育树
3.2 菌株JC-106生长特性
把JC-106接种于LB液体培养基, 分别在不同温度、初始pH和盐度下培养.发现其在15～40 ℃、pH 6～8、盐度0～4%的条件下生长良好, 菌株最适生长温度为35 ℃, 最适pH 8, 最适盐度为1% (图 2A、B、C).JC-106在原油为唯一碳源的培养基生长情况如图 2d所示, 15 ℃培养时, JC-106在最初1～3 d生长缓慢, 3 d后菌体数量明显增长, 15 d时达最高.在35 ℃培养时, 在1 d数量明显增加, 5 d达最高, 7 d后菌体数量开始下降.
图 2菌株JC-106生长特性(a.温度对菌株生长影响;b.初始pH对菌株生长影响;c.盐度对菌株生长影响;d.菌株在含原油培养基中生长特征)
3.3 JC-106对原油降解能力及对烷烃组分利用
JC-106接种于原油浓度为3000 mg·L-1基础培养基, 分别于15和35 ℃培养15 d, 对原油降解率分别为58.18%和41.61%.GC-MS分析发现原油中以直链烷烃为主, 包括正十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十九烷、二十烷、二十一烷、二十四烷、二十七烷、二十八烷、四十四烷.在35 ℃培养时, 对直链烷烃、植烷、姥鲛烷的降解率分别为98.16%、54.60%和85.46%, 15 ℃培养时的降解率分别为96.13%、48.61%和86.83%(图 3).
图 3菌株JC-106降解原油的GC-MS分析(a. RT=13.39为正十五烷, RT=16.18为正十七烷, RT=20.36为十七烷碳酸甲酯(内标物), RT=21.22为正二十一烷;b. RT=16.20为姥鲛烷, RT=17.59为植烷, RT=20.36为十七烷碳酸甲酯, RT=23.46为正二十七烷;c. RT=13.43为正十五烷, RT=16.23为正十七烷, RT=20.41为十七烷碳酸甲酯, RT=21.27为二十一烷;d. RT=12.85为植烷, RT=15.48为正二十烷, RT=16.25为姥鲛烷, RT=20.41为十七烷碳酸甲酯)
3.4 菌株JC-106对不同有机碳源的利用
将JC-106接于不同有机物为唯一碳源基础培养基中, 35 ℃培养7 d, 结果如表 2所示, 菌株在十二烷、二十四烷、正辛烷中生长较好, 也能在邻苯二酚、萘、蒽等芳香烃的培养基中生长.
注: “-”菌落数小于对照组的2倍;“+”菌落数超过对照组2倍低于4倍;“++”菌落数高于对照组4倍低于10倍;“+++”菌落数高于对照组10倍低于20倍;“++++”：菌落数高于对照组20倍.
表 2 菌株JC-106在不同有机碳源中生长情况
3.5 菌株JC-106对含油废水的处理
通过SBR间歇式活性污泥法, 含油废水处理15 d后, 出水各指标浓度和去除率见图 4, 实验组COD、NH4+-N、TP的平均去除率分别为96.49%、96.88%、99.15%, 石油去除率为92.43%, 不加入石油降解菌的对照组去除率为53.80%.菌株JC-106在SBR生物反应器中生长情况见图 5, JC-106在废水中的初始浓度为2.66×109 cfu·mL-1, 在处理含油废水1~15 d的时间内, JC-106数量维持在4.8×1010～1.0×1011 cfu·mL-1.
图 4含油废水出水指标浓度和去除率
图 5菌株JC-106在含油废水中的生长情况
4 讨论(Discussion)
已报道降解石油微生物超过200多种, 不同菌株对石油组分降解效果存在差异, Quatrini等从地中海海岸线石油污染土壤筛选出一株诺卡氏菌、两株红球菌和两株戈登氏菌, 其中红球菌对C20和C28的降解率分别为54.39%和81.29%(Quatrini et al., 2008).Walter等分离的红球菌可降解芘等多环芳烃.Soudi等从石油污染土壤分离的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)SKO-1, 培养56 h后对浓度为1000 mg·L-1苯酚的降解率为99.64%.Johnson等分离的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)只对C5~C10烷烃有很好降解效果.本文从我国西部石油污染土壤中分离的赤红球菌JC-106在15 ℃培养15 d后对原油的降解率为41.61%.GC-MS分析发现原油中96.13%正构烷烃(C14~C44)被降解, 同时也能降解支链和复杂的植烷、姥鲛烷等.在正十二烷、正二十四烷、正辛烷及邻苯二酚、蒽、萘等有机物中较好生长, 表明该菌能利用和分解这些化合物.
含油废水通常呈高COD、高油含量、高氨氮等特点, 对其处理难度较大, 利用高效石油降解菌处理含油废水具有广阔应用前景.徐新阳等从石油污染土壤和含油废水活性污泥中驯化了4株石油降解菌, 对含油废水处理64 h后, 发现对含油废水中COD的去除率最高达68.00%, 混合菌对含油废水中COD的去除率明显高于单一菌种(徐新阳等, 2007).罗群等以活性污泥为微生物菌种来源, 构建了小试反应装置, 利用添加柴油的海水驯化高效石油降解菌, 发现柴油大部分组分得到了不同程度降解, 两个平行反应器中柴油的降解率分别达到98.30%和98.80%(罗群等, 2010).本文自主设计SBR活性污泥处理装置, 采用间歇式活性污泥处理方法研究了添加JC-106对高浓度含油废水处理效果, 经15 d处理后, 出水水质中的COD、NH4+-N、TP的平均去除效率高, 对废水中原油有显著降解效果.菌株在含油废水中稳定生长, 一次添加即可维持所需菌量, 且菌体数量一直维持在较高水平, 表明该菌株能适应废水环境, 又呈现出较好原油去除能力.具体参见污水宝商城资料或http://www.dowater.com更多相关技术文档。
5 结论(Conclusions)
1)从石油污染土壤中筛选出1株高效石油降解菌JC-106, 经细菌形态学、生理生化及16S rDNA序列分析初步鉴定为赤红球菌(Rhodococcus rubber), 该菌具有较广环境适应性, 在15～40 ℃、初始pH 6～8、盐度0～4%条件下生长良好.
2)赤红球菌JC-106在15和35 ℃下培养15 d对原油的降解率分别为41.61%和58.18%, 在35 ℃培养时, 对直链烷烃、植烷、姥鲛烷的降解率分别为98.16%、54.60%和85.46%, 15 ℃培养时的降解率分别为96.13%、48.61%和86.83%.能分解利用十二烷、二十四烷、正辛烷及邻苯二酚、蒽、萘等芳烃.
3)用SBR间歇式活性污泥法, 将赤红球菌JC-106用于含油废水处理, 菌株在含油废水中生长良好, 15 d后处理废水出水的COD、NH4+-N、TP的平均去除率分别为96.49%、96.88%、99.15%, 石油去除率为92.43%, 可用于极端环境石油污染废水处理及污染土壤生物修复.
