1 引言(Introduction)
活性污泥法是最重要的污水处理工艺之一，在世界范围内已被广泛地应用于处理市政污水和工业废水，其工艺流程通常是将厌氧、缺氧和好氧环境结合起来实现除碳磷和脱氮的功能.活性污泥系统是一个功能强大的微生态系统，其中，最主要的自养菌是硝化细菌，即氨氧化细菌(AOB)与亚硝酸盐氧化菌(NOB).为了实现持续稳定的硝化效果，污水处理厂通常将曝气池中的溶解氧(DO)浓度控制在2 mg·L-1以上.但在较低的DO浓度下，完全混合式或者生物膜反应系统中也能实现完全的硝化作用.如果污水处理厂能在低DO环境下实现稳定达标，那么将大大降低污水厂的运行能耗.本研究通过一个长期运行的缺氧/好氧(A/O)推流式活性污泥小试试验系统，考察系统的脱氮效果和系统内硝化细菌群落结构随DO浓度变化的规律，探讨低DO生物脱氮的可能性，以期为实际污水厂在低DO浓度下实现稳定高效的硝化效果，节约能耗提供可靠的理论依据.
2 材料与方法(Material and methods) 2.1 材料
接种污泥取自北京北小河污水处理厂;进水为人工配水，COD为300~400 mg·L-1，NH4+-N浓度为45~55 mg·L-1，pH控制在7.5~8.5.
2.2 反应器装置和运行条件
采用缺氧/好氧(A/O)推流式活性污泥工艺，缺氧和好氧池总体积为37.5 L，缺氧池/好氧池的体积比为1:4，水力停留时间为9 h;沉淀池体积为24 L，停留时间为3 h.进水流量为96 L·d-1，混合液回流比R=200%，污泥回流比r=150%.实验装置如图 1所示.
图 1 反应器装置示意图(1.进水桶，2.进水泵，3.A/O反应池，4.搅拌器，5.曝气头，6.内回流泵，7.污泥回流泵，8.二沉池)
在实验过程中，温度维持在20~25 ℃，SRT为20 d，反应器初始污泥浓度在3000 mg·L-1左右.以DO为3 mg·L-1启动反应器，待系统稳定后将DO逐渐降低到2、1、0.5、0.3和0.2 mg·L-1运行，在本研究中，3和2 mg·L-1属于高DO浓度工况，而1、0.5、0.3和0.2 mg·L-1属于低DOI浓度工况.
2.3 水质和污泥性质测定
系统运行期间每隔2~4 d取水样测定进出水水质，采用国标法进行测定,检测项目包括COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N和TN.在每个工况的运行后期采集活性污泥样品，置于-80 ℃保存. MLSS和SVI分别采用马弗炉燃烧减重法和30 min沉降法测定.
2.4 硝化细菌群落结构分析 2.4.1 DNA的提取
用改进的Zhou法提取活性污泥的DNA，即玻璃珠振荡-SDS-氯仿异戊醇法.
2.4.2 硝化细菌的聚合酶链式反应(PCR)扩增
AOB的扩增：采用其功能基因amoA的引物对amoA-1F(GGGGTTTCTACTGGTGGT)和amoA-2R(CCCCTCTGCAAAGCCTTCTTC)进行PCR扩增，扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性 60 s，51 ℃退火 90 s，72 ℃延伸90 s，共40个循环;最后在72 ℃下延伸10 min，冷却至4 ℃保存.
NOB的扩增：对于Nitrobacter，选用F1370 F1(CAGACCGACGTGTGCGAAAG)和F2843 R2(TCCACAAGGAACGGAAGGTC)进行PCR扩增，扩增程序为：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性 30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 45 s，共35个循环;最后在72 ℃下延伸5 min，冷却至4 ℃保存;对于Nitrospira，选用NSR 1113f(CCTGCTTTCAGTTGCTACCG)和NSR 1264r(GTTTGCAGCGCTTTGTACCG)进行PCR扩增，扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环;最后在72 ℃下延伸15 min，冷却至4 ℃保存.
每种引物对的前端引物附40 bp的GC夹,便于后续的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析，PCR反应的产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测.
2.4.3 DGGE分析
将4 μL PCR样品和1.5 μL 6倍加样缓冲液混合，采用Bio-rad突变检测系统，用8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度为45%~75%，在110 V的电压下60 ℃电泳6 h，用SYBR GREEN I染料对凝胶进行染色，获得DGGE指纹图谱.
2.4.4 基因测序
用洁净的手术刀切取DGGE图谱中的目的条带，利用聚丙烯酰胺DNA回收试剂盒(索莱宝科技公司，北京)进行回收，回收纯化后的DNA用同样的对应引物对进行PCR扩增，产物送上海英骏生物公司进行测序.序列通过NCBI基因库进行在线BLAST比对分析.
2.4.5 相似性和多样性分析
通过比较相似性系数(Cs)来分析样品图谱的相似性.试验所得图像用BIO-RAD的Quantity One软件分析.微生物多样性指数采用Shannon指数(H)表示,公式为：H=-∑PilgPi，其中，Pi=ni/N，ni为峰面积，N为所有峰的总面积.
3 结果讨论(Results and discussion) 3.1 不同DO条件下A/O系统的脱氮效果和污泥性质 3.1.1 不同DO条件下A/O系统的脱氮效果
图 2和图 3分别显示了在不同DO条件下A/O小试系统内进出水的氮素浓度和去除率.硝化过程是耗氧反应，当小试系统曝气池中的DO浓度维持在3 mg·L-1和2 mg·L-1时，系统在很短的时间内就能实现很好的硝化效果，当改变曝气池中的溶解氧浓度，系统在几天之内氨氮的去除率即可稳定.当把系统曝气池中的DO调至1 mg·L-1时，由于突然从高DO状态调节至低DO状态，运行初始阶段出水水质存在波动，但经过2周左右的培养和驯化后出水氨氮和总氮均达到了稳定状态，继续降低曝气池中的DO浓度，使其维持在0.5 mg·L-1时，出水氨氮和总氮并未出现较大的波动，氨氮的平均去除率均为98%以上，总氮的平均去除率为85%以上.当进一步降低DO至0.3 mg·L-1时，尽管经过30 d的连续运行，氨氮的平均去除率下降到了95.4%，总氮的平均去除率为83.46%，整个过程出水水质波动较大，难以达到稳定的状态. 然而，当DO继续降低到0.2 mg·L-1时，系统出现了大幅度波动，出水氨氮和总氮浓度非常高，连续运行了30 d后，出水水质也未达标. 这些水质结果表明该系统的运行DO浓度只能降低到0.5 mg·L-1.
图 2 A/O小试系统内进出水的氮素浓度
图 3 A/O小试系统内氨氮和总氮的去除率
传统生物脱氮过程的硝化反应是在好氧条件下进行的，氧气作为电子受体，氮元素作为电子供体，将氨氮氧化为硝酸盐氮.因此，为了能充分实现硝化反应，污水处理厂往往将DO设计到2 mg·L-1以上(Park et al.，2004). 根据本研究的结果，在DO为0.5 mg·L-1的情况下，系统也能很好地实现硝化作用，这样可以大幅度节约硝化反应所需要的能源.当DO从0.5 mg·L-1继续降低到0.3 mg·L-1甚至到0.2 mg·L-1，系统曝气池中的硝化效果受到了较大的制约，这可能是因为在此DO浓度下曝气池中污泥易于沉降，泥水难以达到充分的混合.为了保证在此浓度下依然能达到较好的脱氮效果，可以在曝气池中加装搅拌器通过搅拌作用使泥水充分混合，但这会增加能量的消耗.另外，还可以通过增大污泥停留时间(SRT)来补偿低DO工况下由于氧气不足所造成的脱氮效果下降. Liu等(2013)的研究结果也证明了这一点，他们考察了SRT为10 d和40 d两种情况下，当DO降低到0.2 mg·L-1以下时，在SRT为10 d的系统中硝化效果很难达到稳定，而在SRT为40 d的系统中硝化效果较为稳定.
3.1.2 不同DO条件下A/O系统的MLSS和SVI的变化规律
随着DO浓度的降低，活性污泥的MLSS和SVI均呈上升趋势. MLSS增加的幅度不是很大，DO为3、2、1、0.5和0.3 mg·L-1时，系统达到相对稳定状态时活性污泥的平均MLSS分别为3925、4155、4550、4910和5150 mg·L-1.总的来说，MLSS随着DO的降低而增加，这也与其它文献报道的研究结果相一致.SVI也是随着DO的降低而升高，系统内的DO为3和2 mg·L-1时，活性污泥的SVI值在60~100 mL·g-1之间，活性污泥具有很好的沉降性能. DO为1 mg·L-1的工况下，活性污泥的SVI值在100~120 mL·g-1之间，沉降和凝聚性能依然很强.DO为0.5 mg·L-1时，活性污泥的SVI值在140~160 mL·g-1之间，也属于较正常的范围.但当DO浓度降低到0.3 mg·L-1运行时，系统中的活性污泥的SVI值在160~180 mL·g-1之间，处于膨胀状态，这也很好地证明了DO浓度为0.3 mg·L-1时，系统出水水质很难稳定达标的结果.
3.2 硝化细菌群落分析 3.2.1 AOB群落结构和多样性变化
5个不同DO工况下AOB的amoA功能基因DGGE图谱如图 4a所示.由图可以看出，各个工况下的AOB菌群丰富度相对较单一，共检测到8条优势条带，分别标记为1~8. AOB的群落结构随着DO浓度的降低而发生了变化，在每个工况下都存在的优势细菌为条带4和6所代表的细菌. 当DO降低后，DO浓度为3 mg·L-1时存在的优势条带7却消失了，而且在DO浓度为0.5 mg·L-1时，出现了新的优势条带5.
图 4 不同DO条件下AOB的DGGE图谱(a)和所有条带的检测示意图(b)
图 4b显示，从高DO变化到低DO，系统内AOB群落结构的动态变化率约为20%~40%，属于中等程度的变化(Miura et al.，2007; Wang et al.，2012)，高DO(3和2 mg·L-1)和低DO(1、0.5和0.3 mg·L-1)环境中AOB种群多样性指数(H)较为相似(表 1).在不同的DO环境下，A/O小试系统中AOB的多样性均处于较高的水平.DO为3 mg·L-1时小试A/O系统中AOB的多样性最高，AOB的种群多样性随DO浓度的降低而减小，但减小的幅度很小，DO的降低并未对AOB的群落结构造成太大的影响，系统中各种优势细菌分布的均匀性和稳定性使得系统中AOB群落始终处于很稳定的状态，保证了系统氨氧化功能的稳定性.
表 1 不同DO条件下各种硝化细菌的多样性指数(H) Table 1 Shannon index of nitrifying bacteria under different DO conditions
图 4a中标有阿拉伯数字的优势条带的测序结果显示(表 2)，AOB均属于Nitrosomonas，未检测出有Nitrosospira，其中，条带1、2、3和4属于Nitrosomonas-like cluster，条带 5属于Nitrosomonas europaea，条带6和7均为Nitrosomonas oligotropha所属的细菌.条带5和7均属于低DO(0.5 mg·L-1)环境中的优势AOB，由此说明，所属Nitrosomonas europaea和Nitrosomonas oligotropha 的AOB均可在低DO的环境中生存，特别是Nitrosomonas europaea所属的AOB非常适合在0.5 mg·L-1的DO浓度下生存.这一结果也与其他研究者的结果相一致(Park et al.，2008; Liu et al.，2013).
表 2 DGGE条带的测序结果 Table 2 Sequencing analysis of DNA from DGGE bands
3.2.2 NOB群落中Nitrobacter群落结构的变化
由图 5a可知，Nitrobacter的群落结构随DO的降低发生了明显的变化，高DO环境(3和2 mg·L-1)的Nitrobacter群落与低DO环境(1、0.5和0.3 mg·L-1)的Nitrobacter群落结构存在较大的差异，DO为1和0.5 mg·L-1工况下Nitrobacter的群落结构最为相似，共同的优势种群为条带Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5、Nb6、Nb7，Nb8则在DO为0.5 mg·L-1的环境下更为丰富，Nb18是DO为1 mg·L-1工况下存在的优势条带.当DO继续降低至0.3 mg·L-1时，系统中的优势种群转变为Nb4、Nb21、Nb22、Nb23，系统中的优势种群数量明显降低.
图 5 不同DO条件下Nitrobacter的DGGE图谱(a)和所有条带的检测示意图(b)
图 5b显示，DO为1和0.5 mg·L-1工况下的Nitrobacter群落结构最为相似，高DO(3和2 mg·L-1)和低DO(1、0.5和0.3 mg·L-1)环境下Nitrobacter的群落结构相似性较低，不同DO环境中的Nitrobacter群落结构差异较大，但1、0.5和0.3 mg·L-1工况下的Nitrobacter群落结构相似性较高. Shannon-Weiner 指数(H)显示(表 1)，不同DO环境下的Nitrobacter群落结构差异较大，但每个DO工况下的优势种群数量均较高，优势细菌的均匀性也较高，因此，每个DO工况下的Nitrobacter群落均处于稳定状态，保证了系统硝化功能的稳定性.
测序结果显示(表 2)，系统中鉴定出的Nitrobacter可分为3类，分别为Group1 Nitrobacter、Group2 Nitrobacter和Group3 Nitrobacter，其中，Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5、Nb6、Nb7、Nb8、Nb9、Nb21、Nb22和Nb23属于Group1 Nitrobacter，也是数量最多的一类Nitrobacter，Nb15、Nb16、Nb17、Nb18、Nb19和Nb20属于Group2 Nitrobacter，Nb12、Nb13和Nb14属于Group3 Nitrobacter.因此，结合图 5b可以进一步看出，系统DO从高浓度(3、2 mg·L-1)降低到低浓度(1、0.5和0.3 mg·L-1)时，系统中的Nitrobacter的种类从Group2和Group3转变成了Group1.另外，从测序结果也可以看出，N. winogradskyi系统中的优势Nitrobacter，但在高低DO工况下，它们属于不同的发育分支.
3.2.3 NOB群落中Nitrospira群落结构的变化
由图 6a可知，不同DO条件下的Nitrospira群落结构变化较小，系统中的优势细菌始终为Np3和Np4，相比于有着丰富群落结构的Nitrobacter，系统中Nitrospira的优势种群较少.
图 6 不同DO条件下Nitrospira的DGGE图谱(a)和所有条带的检测示意图(b)
图 6b显示了Nitrospira的DGGE图谱的条带分布、强度及每个工况的DGGE图谱各样品间的相似性.总体而言，不同DO条件下小试A/O系统曝气池中的Nitrospira种群相似性较高，种群结构没有发生较大的改变. 高DO(3和2 mg·L-1)和低DO(1、0.5和0.3 mg·L-1)环境下Nitrospira的群落结构相似性较高，从高DO变化到低DO，系统内细菌群落结构的动态变化率约为10%~40%，变化程度较小.因此，DO的变化并未对Nitrospira的种群结构和多样性产生较大的影响，不同DO环境中的Nitrospira群落结构相类似. Shannon-Weiner 指数(H)显示(表 1)，高DO下的Nitrospira多样性相对较低，而在0.5 mg·L-1的系统中，两种Nitrospira均为优势菌，其均匀度较高，因此，相应的多样性指数较高.
测序结果显示(表 2)，系统中鉴定出的Nitrospira均属于Group1 Nitrospira，系统中并未检测出Group2 Nitrospira中的细菌，Np1、Np2、Np3、Np4所代表的细菌均属于同一类细菌，而且同源性很高，由此也说明，小试A/O系统中Nitrospira的种类较单一，相比于Nitrobacter丰富的种群，Nitrospira的种类较少. 这也与类似的研究结果相一致(Park et al.，2008).
由Nitrobacter和Nitrospira的多样性指数可以看出，小试A/O系统中最主要的NOB为Nitrobacter.虽然Liu等(2013)的研究结果表明，在长期的低DO环境下，Nitrospira-like比Nitrobacter-like的NOB数量更多，但Nitrobacter和Nitrospira具有不同的生存策略，Nitrospira遵循的是K策略，更适应于在低浓度的亚硝酸盐环境中生存，Nitrobacter的生长实行的是r策略，在亚硝酸盐浓度很低的环境中竞争不过Nitrospira，但当有足够的亚硝酸盐存在时，Nitrobacter的生长速度比Nitrospira更快. 在缺少亚硝酸盐的环境中，Nitrospira的含量更丰富，而在本研究的A/O系统中亚硝酸盐并不是NOB生长的限制因子，因此，Nitrobacter是小试A/O系统中最主要的NOB，主要贡献了亚硝酸盐的氧化作用.
4 结论(Conclusions)
1)当DO浓度从3 mg·L-1降低到0.5 mg·L-1时，本研究中的推流式A/O小试系统仍然能保持很好的脱氮效果，氨氮和总氮的去除率分别达到了98%和85%以上;当DO进一步降低到0.3和0.2 mg·L-1时，出水水质指标不能达标，系统运行难以达到稳定状态.
2)PCR-DGGE的解析结果表明，A/O小试系统中AOB群落结构的动态变化水平约为20%~40%，Nitrospira群落结构的动态变化水平约为10%~40%，AOB和Nitrospira的群落结构随DO的变化并不显著. 而Nitrobacter的群落结构随DO的降低发生了明显的变化，不同DO环境中的Nitrobacter群落结构存在较大差异.具体参见污水宝商城资料或http://www.dowater.com更多相关技术文档。
3)测序结果表明，A/O小试系统活性污泥中的优势AOB主要为Nitrosomonas oligotropha、Nitrosomonas-like和Nitrosomonas europaea，Nitrosomonas oligotropha的AOB更适宜在低DO的环境中生存. 系统中的Nitrobacter包括Group1 Nitrobacter、Group2 Nitrobacter和Group3 Nitrobacter 3类中的细菌，其中，Group1 Nitrobacter是最多的一类Nitrobacter，也是适应在低DO环境下生存的Nitrobacter.小试A/O系统中Nitrospira主要的优势菌种始终是Group 1 Nitrospira.
