污水再生技术是水资源可持续发展的重要组成部分, 但膜污染制约了污水再生回用的推广和应用.城市污水经二级生化处理后剩余的难降解有机物(effluent organic matter, EfOM), 是超滤过程中膜污染产生的重要原因. EfOM来源复杂, 大量的研究事实证明, 多糖、蛋白质、腐殖酸类等是EfOM的主要构成物质, 但它们物理化学性质相近, 分离区分困难, 导致了对EfOM的理化特征与膜污染行为间的相互关系尚未明确.如：多数研究认为大分子蛋白质类、多糖是膜污染的主要贡献者, 糖类在任何材质的超滤膜界面都最易形成膜污染.但也有研究认为腐殖酸类是控制超滤过程中膜污染速率和程度的主要物质. Shen等认为在亲水化改性的聚偏氟乙烯(PVDF)微滤膜上, 亲水性污染物引起的通量下降最快.但也有大量的研究认为疏水性膜上形成的吸附污染远大于亲水性膜.这些不确定的研究结果, 对二级出水超滤再生的抗污染改性膜的选择、生产及设计造成了困惑.因此, 准确检测城市污水二级出水的优势污染物及其分布, 对明确二级出水超滤膜污染的形成过程和机制, 有效干预和防范膜污染的形成有重要的意义.
直接光谱学分析手段不能适用于类似EfOM等的复杂混合体系中特定污染物的定量检测.双缩脲法、苯酚法、层析法等国标方法, 对蛋白质、多糖和腐殖酸的检测过程复杂, 且灵敏度低、准确度不高.染料探针-光谱技术是利用在特定的pH下, 荷电大分子有机物通过静电作用力与染料结合形成复合体, 导致染料的光谱学特征吸收发生较为敏感的变化结果(增敏作用), 根据这种增敏作用与大分子物质含量间的相关性关系, 而建立的对复杂体系中的大分子有机物含量进行检测的一种方法.如：多糖与蛋白质均为复杂结构的多官能团结构的大分子物质, 可以与染料通过静电力结合、富集并形成复合体, 使其染料浓度远高于溶液中的游离浓度, 散射粒子相应体积增大, 可以观察到染料的共振光散射强度增强.染料甲苯胺蓝(TB)可被HA有效包覆, 使TB的紫外光谱吸收降低.染料探针-光谱分析技术操作过程简单、实时快速, 近年来引起了国内外学者的关注.但染料探针-光谱技术, 并未在二级出水中大分子有机污染物的检测中得到明确的应用.
牛血清蛋白(BSA)、海藻酸多糖(SA)和腐殖酸(HA), 常被作为废水中三类典型污染物蛋白质、多糖和腐殖酸的代表性标准物质.本文以刚果红(CR)、中性红(NR)和TB分别作为BSA、SA及HA的染料探针, 开发通过染料探针-光谱学分析技术, 对二级出水中的优势污染物含量进行快速检测的方法, 旨在为城市污水二级出水的污染物去除及超滤再生处理过程中的膜污染干预和防范提供理论参考依据.
1 材料与方法 1.1 试剂
腐殖酸(HA)和海藻酸钠(SA)均来自Sigma公司, 分析纯;牛血清蛋白(BSA)来自上海蓝季, AR, MW 67000;刚果红(CR)、中性红(NR)、甲苯胺蓝(TB)、氢氧化钠, 天津科密欧, 分析纯; 盐酸(HCl, 西安三浦, 分析纯); 去离子水(西安交通大学水工作室).
二级出水样品来自西安市第四、第五、第八污水厂生化处理过程的二级出水, (分别标记样品为S1~S4), 其水质指标如表 1所示, 其中pH由精密pH酸度计(pHS-3S, 上海)测得, COD、总氮、SS分别按高锰酸钾(标准号：GB/T 15456-2008)、纳氏试剂分光光度法(标准号：HJ 535-2009)、重量法(标准号：GB/T 11901-1989)等国标测定.水样经0.45 μm滤膜过滤处理储藏于4℃冰箱中备用.
1.2 溶液配制
标准液配制：分别将标准样品BSA、SA、HA溶于去离子水中, 室温搅拌12h, 0.45μm滤膜过滤, 配制成浓度为1g ·L-1的溶液为贮备液, 储备在4℃冰箱中备用.
二级出水水样配制：以COD和吸光度为浓度参照, 对二级出水样品稀释.
共振光谱实验中以B-R缓冲溶液调节pH, 紫外光谱实验中以柠檬酸钠-磷酸为缓冲液调节pH.加样顺序：缓冲液→大分子溶液→染料溶液.
1.3 EfOM优势污染物及其分布 1.3.1 EfOM标准污染物代表物的染料探针-光谱法定量
蛋白质：以BSA为蛋白质代表物, CR为BSA染料探针, 以CR-BSA的RLS光谱特征吸收(λ=364 nm)为检测波长.以B-R缓冲溶液调节pH, 考察溶液pH对RLS强度的影响, 在最佳pH下, 作BSA标准曲线.
多糖：以SA为多糖代表物, NR为SA染料探针, 以NR-SA的RLS光谱最大特征吸收(λ=292.6 nm)为检测波长.以B-R缓冲溶液调节pH, 考察溶液pH对RLS强度的影响, 于最佳pH下, 做SA标准曲线.
腐殖酸：以TB为HA的染料探针, 以TB-HA的紫外光谱特征最大吸收波长(λ=630 nm), 用柠檬酸钠-磷酸缓冲溶液调节pH值, 考察溶液pH对紫外吸收强度的影响, 在最佳pH下, 做HA标准曲线.
1.3.2 二级出水样品的优势污染物定性
以紫外光谱仪(THERMOE、UV-2100, 操作参数：λ为200~700 nm)、三维荧光光谱仪(3D-EEM, HITACHI公司, F-7000型, 分析参数：Ex为300~500 nm, Em为300~500nm), 检测二级出水样品的特征谱图.对比二级出水水样与BSA、HA、SA这3种标准样品间的特征吸收光谱, 确认二级出水样品中的优势污染物.
1.3.3 二级出水样品优势污染物定量分析
染料探针法：根据2.3.1节的定性分析结果, 结合2.3.2节分析测试条件, 以COD为依据, 以缓冲溶液将二级出水稀释至适宜的浓度.以染料探针法测定二级出水样品中蛋白质、多糖及腐殖酸含量及分布.
国标法：参照国标《出口乳、蛋、豆类食品中蛋白质含量的测定考马斯亮蓝法》(编号：SN), 测定样品中的蛋白质, 参照国标《出口植物源食品中粗多糖的测定苯酚-硫酸法》(编号：SN), 测定样品中的多糖含量.对比验证染料探针-光谱分析结果.
2 结果与讨论 2.1 染料探针光谱对BSA、SA和HA的定量分析 2.1.1 BSA的定量分析
在静电作用下, 生物大分子表面吸附阴离子染料, 导致生色团聚集, 致使CR的RLS强度大幅增强.图 1(a)为CR和CR-BSA溶液(pH=2.25)于200~650 nm下的RLS谱图.从中可知, 加入大分子BSA后CR的共振光强度大幅增强, 是由于荷负电CR与荷正电BSA间形成了CR-BSA络合物所致.且CR-BSA的谱图特征与CR完全相似, 最大吸收峰值均为364 nm.
pH对CR-BSA络合物体系的共振光散射强度(I)的影响如图 1(b)所示.在pH为1~9范围内, CR-BSA络合物的I值, 在等电点pH=4.7时最小.与等电点时, 静电荷为0, BSA与CR间吸附能力最弱有关.而在等电点pH=4.7前, CR-BSA的I值高于等电点的I值, 并在pH=2.25时最大, 这与双偶氮阴离子染料CR在等电点前因质子化而与荷正电的BSA间的吸附能力有关.高于等电点后, BSA去质子化而荷负电, 并在pH=2.25时, CR与BSA间因二者间电离平衡的协同作用而有最大程度的吸附效应.因此, 选择pH=2.25为BSA测定的优选条件.
在最优条件下考察了BSA浓度对I值的影响, 如图 1(c)所示. BSA浓度在0~8 mg ·L-1间, BSA溶液浓度与I间的线性关系较好, R=0.986.之后, 吸光度随浓度变化平缓.因此, BSA测量浓度范围定为8 mg ·L-1以下.
2.1.2 SA的定量分析
图 2(a)为pH=4时NR-SA的RLS光谱, 从中可以看出, 在NR溶液中加入大分子SA样品后, 共振光散射强度大大增强, 这与CR-BSA的共振光散射光谱规律一致.选择NR-SA络合物的I值最大时的吸收波长292.6 nm为SA的检测实验波长, 考察pH值对NR-SA体系的I值的影响.如图 2(b)所示：在pH=4时, 带正电NR与荷负电的SA间产生较强的吸附作用, NR-SA络合物的I值最大.随着pH的增大, NR荷负电性逐渐增强而与SA间的吸附能力降低, 导致NR-SA的I值降低.
当pH=4时, 考察了SA浓度与I值间的线性相关性.如图 2(c)所示：在最优实验条件下, SA浓度在0~10 mg ·L-1范围内, NR-SA与I值间的线性相关系数为R=0.988.
2.1.3 HA的定量分析
在pH=7时, TB和TB-HA紫外分光图如图 3(a)所示：HA的引入导致了TB溶液的紫外吸收值锐减, 是因为含有复杂官能团的HA, 会对TB小分子产生强烈的包覆作用, 减弱了TB的紫外吸收作用.以TB-HA的紫外最大吸收波长630 nm为实验波长, 对HA进行定量分析, 考察pH对TB-HA体系紫外吸收强度的影响.如图 3(b)显示, 在pH=7时, 能获得TB-HA复合物的最大紫外吸收强度, 这说明中性环境中, 弱碱性TB与弱酸性HA间能产生最强的吸附效应.并在pH=7时, HA浓度低于20.0 mg ·L-1时, 吸光度值ΔA与HA浓度成反比, 有良好的线性相关性, R=0.999[见图 3(c)].
2.2 标准污染物混合样品的定量分析
考察了染料探针分析方法, 对EfOM的3种代表性污染物混合样品的直接检测.表 2为将3种EfOM代表性污染物的二元和三元混合水样, 通过染料-光谱探针法检测所得的实验结果.从中可知, 染料探针对不同混合样品中分析检测时, 污染物的回收率均不低于96%, 标准偏差最大不超过0.11.说明该方法可用于直接确定混合EfOM中各种优势污染物的代表性成分.
2.3 染料探针-光谱分析法对二级出水优势EfOM的定量检测 2.3.1 二级出水样品中优势污染物的确定(光谱学定性)
图 4为4种水样的紫外吸收光谱, 其中S1与S2的紫外吸收光谱图中几乎无吸收, 但S2在紫外区的吸收峰值略高于S1, 可能与S2中含有少量腐殖酸类物质有关. S3在紫外区250~300 nm处出现了与BSA的芳香族氨基酸残基相类似的吸收峰. S4与HA的紫外特征吸收光谱比较相似.紫外光谱图的初步分析认为：样品S1中无BSA、HA等含复杂官能团如腐殖类及蛋白质等污染物.其COD值的贡献可能主要来自于多糖, S2中应以多糖和少量腐殖酸类或蛋白质物质为主.而样品S3中富含蛋白质, S4中含腐殖酸类物质.
在pH=11下, 对二级出水样品S3和S4进行了三维荧光光谱分析, 如图 5所示(S1和S2无荧光吸收, 图未显示).对比BSA、HA的标准谱图可知, 样品S4在Ex/Em=(300~370)/(400~500)nm的吸收为腐殖酸类的特征峰; 而样品S3在Ex/Em=(235~240)/(340~355)nm与Ex/Em=(280~285)/(320~335)nm为蛋白质类物质特征峰.结合两种光谱特征的初步分析认为：样品S1中的优势污染物为多糖, S2的优势污染物为多糖与腐殖酸, S3的优势污染物为蛋白质, S4的优势污染物为腐殖酸.
2.3.2 二级出水优势污染物及其分布
依据4种二级出水样品的光谱学特征, 分别利用染料探针-光谱分析法, 并结合国标检测方法, 对样品中的优势污染物成分进行了检测和对比.如表 3所示, 样品BSA和SA的浓度采用染料探针-共振光散射方法测定, HA含量用染料探针-紫外分光光度法测定(其中蛋白质、多糖、腐殖酸浓度值根据3.1节的标准曲线计算所得)每个样品平行测定3次, 所得标准偏差在0.002~1.62 mg ·L-1之间.如表 3所示, S1与S2中糖类所占比例最高, 而S2中HA量高于S1.而S3以蛋白质含量居多, S4中主要含腐殖质类.
表 3显示RLS结果与考马斯亮蓝法和苯酚-硫酸法测定的结果间较为一致.
3 结论
本研究探讨了染料探针技术, 在定量检测城市污水二级出水中大分子类有机污染物中的应用性.分别以BSA、SA、HA标准物, 代表蛋白质、多糖、腐殖酸等EfOM的典型污染物, 利用标准物与染料刚果红、中性红及甲苯胺蓝形成大分子络合物, 在RLS和紫外分光光度吸收值的增敏和衰减效应间的线性关系, 在适宜的pH值和浓度范围下, 建立了3种代表物的标准曲线.通过标准物的二元、三元混合溶液样品中的检测回收率, 考察并确认了染料探针检测方法的相对误差.以紫外和3D-EEM的光谱学分析为定性依据, 对4种二级出水样品中的优势污染物, 通过染料探针技术的定量检测, 与国标法间有良好的一致性.染料探针技术操作简便, 在城市污水二级出水优势污染物的检测中有潜在的应用性.可作为污水再生处理技术中, 膜前预处理、膜污染预测和防范及调控的指导依据.具体联系污水宝或参见http://www.dowater.com更多相关技术文档。
