相比于城市，农村居住人口密度低，因此，农村生活污水主要采用分散处理的方式。在我国北方，分散污水处理系统最大的一个挑战是冬季低温期的保温。相对于降解有机污染物的异养菌，将氨氮转化为硝酸盐的硝化功能菌属于自养菌，对温度非常敏感。亚硝化单胞菌属和氧化亚硝酸盐的硝化杆菌属及硝化螺旋菌属活性最高的温度分别为35、38和35 ℃。当温度从30 ℃降至10 ℃时，氨氧化速率和亚硝酸盐氧化速率都会出现大幅降低。因此，低温期生物处理系统硝化性能的保障对于北方农村生活污水处理至关重要。但针对如何在接近4 ℃的水温条件下维持硝化功能的研究却不多见。
生物接触氧化工艺是分散型污水处理系统中通常采用的方式之一，具有污泥种群结构相对稳定，运行维护相对简单的特点。这一特点有可能使系统在冬季低温期维持较为稳定的硝化细菌种群。基于这样一种假设，本研究在实验室构建了2套平行运行的生物接触氧化反应器，以某城市污水厂进水为原水研究了水温从20 ℃降至10 ℃和5 ℃时反应器的生物硝化性能，并分析了细菌种群、特别是硝化细菌种群的动态变化。研究结果可为低温下分散污水处理系统中硝化性能的保障提供科学基础。
1 材料与方法
1.1 反应器设计与运行
实验室生物接触氧化反应器如图1所示。反应器有效总体积2.4 L，分为好氧区与沉淀区2个部分;其中好氧区有效体积1 L，沉淀区体积1.4 L。反应器接种污泥为北京市某城市污水处理厂活性污泥，反应器进水为曝气沉砂池后出水。反应器内的球形生物填料直径约3 cm，每反应器中含16个生物填料。平行反应器的溶解氧浓度(DO)均控制在2 mg·L−1以上。反应器生物挂膜成功后共运行147 d，其中20 ℃运行10 d，10 ℃运行102 d，5 ℃运行35 d。水力停留时间(HRT)初始为8 h，第45 天增至10 h，第71 天增至12 h，第96 天增至14 h。
图1 生物接触氧化反应器工艺示意
1.2 分析方法
每3 d采样监测进出水中COD、氨氮(NH4+-N)、亚硝酸盐氮(NO2−-N)和硝酸盐氮(NO3−-N)浓度;COD测定使用了快速测试设备(默克NOVA60，德国)，其他3类指标分别采用《水和废水监测分析方法》中的标准方法测定。污泥浓度(MLSS)通过重量法测定。
1.3 硝化速率的测定
从平行反应器中各取2个生物填料加入到500 mL人工配水中，在20、10和5 ℃条件下进行曝气，按一定时间间隔取水样测定NH4+-N、NO2−-N和NO3−-N。配水主要成分为NH4Cl (NH4+-N浓度28 mg·L−1)，微量元素储备液1 mL·L−1。同时，取某城市污水处理厂活性污泥(水温为14 ℃)，在MLSS稀释为4 205 mg·L−1、NH4+-N含量为28 mg·L−1的条件下分别测定了20 ℃和10 ℃活性污泥的硝化速度。每次测定平行2次。
1.4 生物量采集
在第10 天、第112天和第147天，从各反应器中分别取2个生物填料，将其置入磷酸缓冲液(PBS)中反复振摇，直至填料颜色变白。2 000 r ·min−1条件下进行污泥洗脱液离心，去上清液用PBS稀释污泥至100 mL。其中，40 mL混合液10 000 r ·min−1离心去上清液后，装入2 mL离心管，在−20 ℃下保存;剩余部分用于污泥浓度(MLSS)分析。同时，采集污水处理厂温度为13 ℃的污泥作为参照。
1.5 高通量测序
DNA的提取采用MP(MP Biomedicals，美国)的土壤DNA提取试剂盒(Fast DNA SPIN kit for soil)。利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，DNA浓度采用仪器NanoDrop2000(Thermo Scientific，美国)测定，检测后保存于−20 ℃冰箱备用。以基因组DNA 为模板，16S rDNA 基因的引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)进行PCR扩增，有效片段500 pb。高通量测序Illumina MiSeq在上海美吉生物有限公司进行。
通过QIIME (http://qiime.org/tutorials/index.html)进行序列处理;根据序列的相似度归为多个操作分类单元(OTU)。对97%的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析，软件平台为Usearch(version 7.0 http://drive5.com/uparse/)。
2 结果与讨论
2.1 反应器的污水处理性能
平行反应器的COD去除效果如图2所示。在147 d的运行期间，进水COD浓度为300~500 mg·L−1，而出水COD浓度基本保持在 30 mg·L−1以下。操作全程温度下降对反应器COD去除的影响甚微。
进水NH4+-N浓度范围为30~40 mg·L−1。当水温降至10 ℃时，出水中的NH4+-N浓度开始出现上升，且NO2−-N发生积累(图2)。运行至第45天时，HRT从8 h调整至10 h，并在第96天增加为14 h，期间出水中的NH4+-N与NO2−-N积累现象均消失。水温降至5 ℃时，2个反应器出水中的NH4+-N与NO2−-N浓度均未再出现明显升高。
图2 生物接触氧化反应器COD、NH4+-N和NO2−-N去除性能
2.2 不同运行温度下的生物接触氧化污泥的比硝化速率
以常规城市污水处理厂的活性污泥为参照，测定了活性污泥、10 ℃生物接触氧化污泥、5 ℃生物接触氧化污泥在不同温度条件下的比氨氧化速率，结果如图3所示。 10 ℃和5 ℃水温条件下运行的生物接触氧化污泥均能维持一定的氨氧化能力。表1总结了这3类污泥在不同温度下的比氨氧化速率和比硝酸盐生成速率。活性污泥在20 ℃下的比氨氧化速率和比硝酸盐生成速率分别为2.44、2.72 mg·(g·h)−1(以MLSS计)，而10 ℃与5 ℃生物接触氧化污泥在20 ℃下的比氨氧化速率和比硝酸盐生成速率仅为0.45、0.8 mg·(g·h)−1和0.41、0.72 mg·(g·h)−1，表明生物接触氧化污泥的硝化速率明显低于活性污泥。但水温从10 ℃降低至5 ℃并未影响生物接触氧化污泥的硝化能力。具体联系污水宝或参见http://www.dowater.com更多相关技术文档。
一般来说，硝化菌的硝化速率随着温度下降而成比例下降。例如，有关稳定塘的研究发现，污泥在5、10、20 ℃下的氨氧化及硝酸盐生成速率(以N计)分别为11.2、20.5、40.4 mg·(g·h)−1 (以MLVSS计) 。因此，生物填料污泥在10 ℃和5 ℃下的比硝化速率相近，表明生物填料中硝化细菌可能发生了富集或种群发生了变化。
图3 不同运行温度下生物填料污泥的NH4+-N氧化速度
表1 生物接触氧化污泥与活性污泥在不同温度下的比硝化速率
2.3 不同阶段生物接触氧化污泥种群结构
为了阐明降温过程中生物接触氧化系统硝化能力基本保持不变的原因，对20、10和5 ℃下运行的生物接触氧化污泥进行了高通量测序分析。
属水平种群维恩图(图4)显示，随着温度的下降，生物接触氧化污泥显著保留了核心种群。3种运行温度下的接触氧化污泥的属数目一共为404种，而共有种属数目为249，占61.6%。当运行水温从20 ℃降低至10 ℃时，这2类生物接触氧化污泥的共同种属数为291，占其总种属数的72.0%;而当运行水温从10 ℃降低至5 ℃时，这2类污泥共同拥有278个属，占其总种属数的68.8%;而初始20 ℃污泥与最终的5 ℃污泥相比，其共同种属也达到了260个，占总种属数的比例为64.4%。
上述结果表明，生物接触氧化污泥具有相当稳定的生物群落结构，在降温过程中保留了数量庞大的核心种群，这可能是温度下降并未导致反应器污染物去除性能下降的重要原因。
图4 不同阶段生物接触氧化污泥属水平venn图
高通量测序结果表明，生物接触氧化反应器中最主要的氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌分别为亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和硝化螺旋菌属(Nitrospira)。图5显示当水温保持在5 ℃连续运行时，生物接触氧化污泥中硝化螺旋菌属和亚硝化单胞菌的丰度反而呈现出上升趋势，这可能是5 ℃生物接触氧化污泥比硝化速率与10 ℃污泥基本一致的重要原因。前期关于膜生物反应器的研究也发现，硝化螺旋菌属在降温过程中(19.7~8.7 ℃)其丰度可以从8.9%增加至最多的15.1% 。然而低温条件下硝化菌群的富集原因仍然有待于进一步深入研究。
图5 各阶段生物接触氧化污泥中硝化菌相对丰度
综上所述，温度下降不可避免地会导致生物硝化速率的下降。但本研究结果表明，通过适当延长水力停留时间，生物接触氧化反应器可以在5 ℃水温下获得良好的硝化效果，这主要是因为生物接触氧化污泥中维持了较高丰度的亚硝化单胞菌属和硝化螺旋菌属，说明生物接触氧化反应器对于维持低温下的硝化性能具有一定的优势。此外，本研究结果也显示，在温度降低之前提高硝化菌的丰度也不失为一种有效的维持低温下硝化效果的措施，这是今后值得深入研究的一项研究内容。
3 结论
1)生物接触氧化反应器在5 ℃、水力停留时间为14 h的条件下，可以维持稳定的硝化性能。
2)硝化速率测定结果显示，将温度由20 ℃降至10 ℃及以下时，显著降低了生物接触氧化污泥的比硝化速率，但在低温条件下，5 ℃与10 ℃生物接触氧化污泥几乎保持了相同的比硝化速率。
3)高通量测序结果显示，降温过程中，生物接触氧化污泥保留了数量庞大的核心种属，同时硝化细菌丰度在长期低温下发生了一定的富集，但相关机制有待于进一步研究。(来源：环境工程学报 作者：杨思敏)
