煤化工企业排放的废水中含有大量的酚、氰油、氨氮、多环芳香族化合物及含氮氧硫的杂环化合物等有毒有害物质，综合废水中CODCr一般在2000～5000mg·L-1，氨氮在200～500mg·L-1，是典型的含有难降解有机化合物的工业废水。据煤化工行业调查分析，约70%的机焦废水未经过脱氮处理直接外排，30%的机焦废水未经任何处理直接外排。废水的超标排放对水产、农作物甚至人类健康都构成了极大危害，因此，寻找高效的污水处理方法是当前急待解决的课题。目前，国内外处理煤化工废水的方法主要有物理法、化学法和生物法。生物法主要通过微生物的新陈代谢作用，将废物吸收、分解，达到治理污染的目的，因其具有经济、绿色、安全、有效的特点，得到了广泛应用。污水中常含有多种性质不同的物质，用单一菌种很难将其彻底降解，在生产中主要以活性污泥法和高效菌剂相结合来处理这一问题。当前，越来越多的国内外学者在污水生物处理过程中引入PCR-DGGE方法，用以研究微生物群落的复杂性，监测种群动态，依据污水处理过程中的群落动态变化，调节实际工艺参数，提高污水处理效率。本研究主要对煤化工废水中筛选出的高效COD降解菌进行生物强化，对菌株进行高效配比研究，制成生物菌剂，研究其在污水处理过程中微生物群落结构的动态变化及降解特性，以期为提高煤化工废水处理系统的效率提供科学依据。
材料
样品来源
样品主要采自中国神华煤制油化工有限公司包头煤化工分公司(污水1)、康达东营环保水务有限公司(污水2)、中海油天津化工研究设计院(污水3)。采回的样品置于4℃保存。
培养基
分离培养基(固体)。牛肉膏1.5g，蛋白胨2.5g，KH2PO40.725g，Na2HPO41.136g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl2·2H2O0.02g，NaHCO385mg，2%琼脂，微量元素Ⅰ，微量元素Ⅱ，蒸馏水1000mL，pH值7.0～8.0。其中，微量元素Ⅰ:FeSO45mg，EDTA5mg;微量元素Ⅱ:EDTA15mg，ZnSO4·7H2O4.3mg，CoCl2·6H2O2.4mg，MnCl26.29mg，CuSO4·5H2O2.5mg，Na2MoO4·2H2O2.2mg，NiCl2·6H2O1.9mg，H3BO30.14mg。将上述配置好的培养基置于0.11MPa，121℃条件下灭菌20min。富集培养基(液体)。C6H12O61.2g，其他成分同分离培养基。培养基配好后置于0.11MPa，115℃条件下灭菌25min。
复筛培养基。配制模拟污水，COD浓度分别为2560，3040，5280mg·L-1，pH值7.0～8.0(用5%Na2CO3和HCl调pH值)。配好的培养基于0.11MPa，115℃条件下灭菌25min。
COD试剂
Ag2SO4，HgSO4，K2Cr2O7，C6H4(COOH)(COOK)，均为分析纯，均购自天津市化学试剂研究所。
DGGE试剂
DuRed核酸染料，40%C3H5NO/Bis(37.5∶1)，50×TAEBuffer，0%变性液(10%Gel)，80%变性液(10%Gel)，10%(NH4)2S2O8，1μL·mL-1TEMED。
煤化工废水COD降解菌筛选
煤化工废水取样后富集培养，采用稀释涂布平板法、平板划线分离法筛选分离COD降解菌。分离纯化菌株，4℃斜面保藏。按5%接种量接种至装有100mL灭菌模拟污水培养基的250mL锥形瓶中，30℃，150r·min-1振荡培养，48h后更换培养基并逐步提高模拟污水COD浓度，测定降解后模拟废水COD浓度，计算菌株降解率。
OD降解率测定
采用快速消解分光光度法对化学需氧量进行测定。取待测菌悬液样品10mL，7000r·min-1离心10min，上清液稀释至COD量程范围内，加入到装有消解液的消解管中，放入HACH消解仪消解，波长600nm测吸光度，超纯水作参照，做标准曲线，计算COD降解率。
ρ(COD)=n[k(As-Ab)+a]。(1)
式(1)中，ρ(COD)为水样COD值，n为水样稀释倍数，k为邻苯二甲酸氢钾COD校准曲线灵敏度，As为试样测定的吸光度，Ab为空白试验测定吸光度，a为校准曲线截距。
M/%=100×(x0-x)/x0。(2)
式(2)中，M为COD降解率，x为反应后COD浓度，x0为初始COD浓度。
生物菌剂的复配研究
将筛选出的5株高效菌株摇瓶培养，采用不同方式进行组合，测各组合COD降解率，得最优复配组合，配制成菌剂进行生物强化研究。具体联系污水宝或参见http://www.dowater.com更多相关技术文档。
生物菌剂的生物强化
取3种煤化工污水进水水样和氧化段活性污泥。在最优降解条件下，将生物菌剂分别接种3种污水培养基，并对高效降解菌的降解特性进行研究。处理1到处理3，分别向污水1到污水3中加入菌剂;处理4到处理6，分别向污水1到污水3中加入菌剂及活性污泥;处理7到处理9，分别向污水1到污水3中加入活性污泥。
每组样品废水体积150mL，接菌量统一按照10%设置，投加污泥量统一为75mL。试验所加活性污泥系生物菌剂强化，出水镜检，微生物量较少时，污泥强化完成。每组试验平行2次。各处理均于30℃，150r·min-1条件下振荡培养，每隔24h测定各处理COD降解率。
PCR
采用OMEGA-SoilDNAKit试剂盒提取污泥DNA，采用LysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR试剂盒提取菌株DNA。PCR扩增采用TouchDownPCR模式运行。先对16SrDNA全长序列进行扩增，引物是27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-TACCTTGTTACGACTT-3');然后再对16SrDNA的V3可变区进行扩增，引物是338f-GC(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和518r(5'-ATACCGCGGCTGCTGG-3')。PCR反应体系(50μL):10×PCRBuffer(Mg2+)5μL，dNTPmixture(各2.5mmol·L-1)4.0μL，引物各1μL(10pmol·μL-1)，模板DNA2.5ng，TaKaRaTaq酶(5U·μL-1)0.25μL，灭菌蒸馏水定容至50μL。PCR反应程序:94℃预变性5min;94℃变性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min，每个循环退火温度降低0.1℃，终至51.5℃，35个循环;72℃最终延伸10min，4℃保存。取2μLPCR反应产物，0.8%琼脂糖凝胶电泳。对菌落16SrDNA的PCR产物进行纯化测序，步确定所分离细菌的分类学地位。
DGGE
采用Bio-Rad公司UniversalMutation检测系统对神华废水的PCR扩增产物进行电泳分离。具体步骤:制备垂直胶，确定分离含有核苷酸改变的DNA片段的最佳梯度范围;制备水平胶，用梯度混合器制备变性剂浓度不同的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度从胶的上方向下方依次递增，待胶凝固后，将胶板放入装有电泳缓冲液的装置中。经前期条件优化，确定DGGE操作条件:样品/上样缓冲液为6∶1，上样15μL，电压60V，60℃条件下电泳15.5h;DuRed凝胶染色，摇床振荡30min，超纯水冲洗脱色;最后用QuantityOne4.6.2软件分析DGGE图谱，得各样品间相似性矩阵图，研究微生物多样性、丰富度、条带强度分布情况和不同处理阶段样品中微生物相似性等。选择条带强度较大的优势菌带，切胶回收，PCR扩增细菌16SrDNA的V3区，DGGE分析是否为单一菌。
本研究筛选得到5株COD高效降解菌，将菌株经复配、污泥强化，得到强化菌剂，对3种煤化工废水COD的去除率均达89.3%以上，抗冲击负荷能力显著增强，菌剂在投加污水后经过适应期后一直占据优势地位，且对高浓度COD污水的处理效果也很理想，表明该菌剂具有发展成为商品菌剂的潜力。开发该商品菌剂有利于节约污水处理成本，对污水处理系统的快速启动也具有积极意义。
