申请日2012.04.02
公开(公告)日2012.08.01
IPC分类号C12N15/87; C02F101/34; C02F3/34; C12N1/21
摘要
本发明公开了一种降解高盐度废水酚转基因细菌的培养以及应用方法，属于污水处理领域。本发明转基因细菌的制备步骤为首先用MGM培养基对盐碱地中的嗜盐菌进行筛选;再用苯酚培养基对黄河水中的降酚细菌进行分离;然后用饱和盐水对嗜盐菌进行处理，最后经过电击法，电脉冲法，高温加热把嗜盐基因导入降酚细菌。本发明转基因细菌针对性强，效率高，提供了一种降解大于20%盐浓度废水中酚的转基因细菌，具有显著的经济效益和社会效益，广阔的应用前景。
权利要求书
1.一种降解高盐度废水酚转基因细菌的培养以及应用方法,其特征在于培养方法为：
(1)以盐碱土壤为嗜盐菌菌源,在温度为35~40°C，pH 7.5～8.5条件下用MGM培养基进行筛选培养2～3d，作为嗜盐菌菌源，冷藏保存;
(2)以黄河水为细菌菌源，在温度35~37°C，pH7.0～8.0条件下用苯酚培养基进行筛选培养16～24h，作为降酚细菌菌源，冷藏保存;
(3)把嗜盐菌放入饱和盐水中，电击6-8h，然后加热到60~70℃，加热3～5min，得到混合液，待冷却后PEG沉降，去除沉淀，保留上清液;
(4) 用CaCl2溶液处理降酚细菌，然后把降酚细菌加入上清液中，涂抹于苯酚培养基上，在温度为35~37°C 条件下培养6-7d，作为转基因细菌菌源;
(5)把得到的转基因细菌涂抹于改良的苯酚培养基上在温度为35~40°C ，pH 7.5～8.5条件下培养3-4d筛选出转基因细菌。
2.根据权利要求1所述的一种降解高盐度废水酚转基因细菌的培养以及应用方法，其特征在于：所述的MGM培养基中以质量百分比计，含有牛肉膏0.2%~0.5%，蛋白胨1%~3%，NaCl 20%~25%，琼脂 1%~3%，CaCl2 0.1%~0.3%，甘油1%~3%，酵母提取物 1%~3%，饱和食盐水65%~75%。
3.根据权利要求1所述的一种降解高盐度废水酚转基因细菌的培养以及应用方法，其特征在于：所述的苯酚培养基中以质量百分比计，含有放线菌酚 1%~ 2% ，NaCl 2%~5%，延胡索酸铁2%~ 5%，甘露醇1%～3%，苯酚 10%~30%，蛋白胨1%~3%，饱和盐水57%~79%。
4.根据权利要求1所述的一种降解高盐度废水酚转基因细菌的培养以及应用方法，其特征在于：所述的改良苯酚培养基中以质量百分比计，含有放线菌酚 1%~ 2% ，NaCl 15%~20%，延胡索酸铁2%~ 5%，甘露醇1%～3%，苯酚 10%~30%，蛋白胨1%~3%，饱和盐水40%~65%。
说明书
一种降解高盐度废水酚转基因细菌的培养以及应用方法
技术领域
本发明涉及一种降解高盐度废水酚转基因细菌的培养以及应用方法，具体涉及一种降解20%以上盐浓度废水酚转基因细菌的培养属于污水处理领域。
背景技术
由于淡水资源越来越紧缺，为了缓解这种局面，在一些沿海城市开始推行直接利用海水资源。将海水广泛应用于电力、化工、机械、建筑、印染及食品等行业，将其作为工业冷却水、工业生产用水，因此产生了高盐度的含酚废水。
高盐度含酚废水流入渠道，江河，湖泊污染地表水，会导致水生动植物的死亡甚至绝迹;可能渗透到地下，污染地下水，如果周边居民采用被污染的地表水或地下水作为生活用水，会危害身体健康，重者死亡;还可能渗入土壤，造成土壤污染，影响植物和土壤中微生物的生长，还会被动植物的摄食和吸收作用残留在体内，而后通过食物链到达人体内，对人体造成危害。
现阶段处理高盐度含酚废水主要有物理，化学，生物3种方法。物理方法主要有电解工艺、膜分离工艺、加热蒸发等例如：公告号为 CN101259519、名称为“一种用于生产覆膜砂的除酚装置及其工作方法”所述是利用加热器加热空气然后使酚汽化。化学方法主要有电化学工艺，光催化氧化，湿式催化氧化，臭氧氧化等。例如：公告号为CN101269841、名称为“除酚用锰氧化物及其处理高浓度含酚废水的方法”所述是利用锰氧化物Mn2+在酸性环境中将酚化合物氧化降解的化学方法。生物方法有传统活性污泥工艺，微生物处理等。传统活性污泥工艺经济实用但其只在4.5%盐浓度下对去除酚类物质有良好效果，微生物处理对盐浓度有很高的要求，例如：公告号为CN101768564A、名称为“一种高效降酚嗜盐菌的制备及其应用”嗜盐菌可以处理盐浓度5%~6%的废水中的酚而不能处理6%盐浓度以上的废水中的酚。而在C.R.Woolard “降解高盐度废水酚的批反应堆”的实验中经过7个月的时间，15%盐浓度废水中酚的去除率达到了99%。物理和化学方法的运营成本太高，不经济。而生物方法又受到了废水盐浓度的限制，不能降解大于20%盐浓度废水中的酚。
发明内容
本发明主要是针对生物方法不能降解大于20%盐浓度废水中酚的问题，提供了一种能够降解大于20%盐浓度废水中酚的转基因细菌的制备方法，通过该方法制备的酚转基因细菌，对含盐量为20%~25%的废水中酚的去除率达到99%以上。
本发明转基因细菌把经过饱和盐水处理，然后电击，高温加热后的嗜盐菌中的嗜盐基因导入了降酚细菌中，得到了一种降酚嗜盐菌，克服了生物法不能处理大于20%盐浓度废水中的酚。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
(1)以盐碱土壤为嗜盐菌菌源,在温度为35~ 40°C，pH 7.5～8.5条件下用MGM培养基进行筛选培养2～3d，作为嗜盐菌菌源，冷藏保存;
(2)以黄河水为细菌菌源，在温度35~37°C ，pH7.0～8.0条件下用苯酚培养基进行筛选培养16～24h，作为降酚细菌菌源，冷藏保存;
(3)把嗜盐菌放入饱和盐水中，电击6-8h，然后加热到60~70℃，加热3～5min，得到混合液，待冷却后PEG沉降，去除沉淀，保留上清液;
(4)用CaCl2溶液处理降酚细菌，然后把降酚细菌加入上清液中，涂抹于苯酚培养基上，在温度为35~37°C 条件下培养6-7d，作为转基因细菌菌源;
(5)把得到的转基因细菌涂抹于改良的苯酚培养基上在温度为35~ 40°C ，pH 7.5～8.5条件下培养3-4d筛选出酚嗜盐菌。
所述的MGM培养基中以质量百分比计，含有牛肉膏0.2%~0.5%，蛋白胨1%~3%，NaCl 20%~25%，琼脂 1%~3%，CaCl2 0.1%~0.3%，甘油1%~3%，酵母提取物 1%~3%，饱和食盐水65%~75%。
所述的苯酚培养基中以质量百分比计，含有放线菌酚 1%~ 2% ，NaCl 2%~5%，延胡索酸铁2%~ 5%，甘露醇1%～3%，苯酚 10%~30%，蛋白胨1%~3%，饱和盐水57%~79%。
所述的改良苯酚培养基中以质量百分比计，含有放线菌酚 1%~ 2% ，NaCl 15%~20%，延胡索酸铁2%~ 5%，甘露醇1%～ 3%，苯酚 10%~30%，蛋白胨1%~3%，饱和盐水40%~65%。
本发明与现有方法相比所具有的优点及效果是：
(1)本发明的转基因细菌可以降解20%～25%盐浓度废水中的酚;
(2)本发明的转基因细菌具有针对性强，除酚效果好的优点。
具体实施方式
实例 1
MGM培养基以质量计，取牛肉膏0.2g，蛋白胨1g，NaCl 20g,琼脂 1g，CaCl2 0..1g,甘油1g,酵母提取物 10g，饱和食盐水 75g。
苯酚培养基以质量计，取放线菌酚 1g，NaCl 2g，延胡索酸铁 2g，甘露醇 1g，苯酚 10g，蛋白胨 1g，饱和食盐水 79g。
改良苯酚培养基以质量计，放线菌酚 1g ，NaCl 15g，延胡索酸铁2g，甘露醇1g，苯酚 10g，蛋白胨1g，饱和盐水65g。
首先以盐碱土壤为嗜盐菌菌源,在温度为35°C，pH 7.5条件下用MGM培养基进行筛选培养2d，作为嗜盐菌菌源，冷藏保存;再以黄河水为细菌菌源，在温度35°C ，pH7.0 条件下用苯酚培养基进行筛选培养16h，作为降酚细菌菌源，冷藏保存;然后把嗜盐菌放入饱和盐水中，电击6h，然后加热到60°C ，加热3min，得到混合液，待冷却后PEG沉降，去除沉淀，保留上清液;再用CaCl2溶液处理降酚细菌，然后把降酚细菌加入上清液中，涂抹于苯酚培养基上，在温度为35°C条件下培养6d，作为转基因细菌菌源;最后把得到的转基因细菌涂抹于改良的苯酚培养基上在温度为35°C，pH 7.5条件下培养3d筛选出转基因细菌。
用该转基因细菌在35°C ，pH 7.0条件下处理某工厂20%盐浓度含酚废水，废水内的酚浓度从100 mg/L降到0.02mg/L，去除率高达99.98%。
实例 2
MGM培养基以质量计，取牛肉膏0.5g，蛋白胨3g，NaCl 25g，琼脂 3g，CaCl2 0.3g，甘油3g，酵母提取物3g，饱和食盐水 65g。
苯酚培养基以质量计，取放线菌酚 2g，NaCl 5g，延胡索酸铁 5g，甘露醇 3g，苯酚 30g，蛋白胨 3g，饱和食盐水 57g。
改良苯酚培养基以质量计，放线菌酚 1g ，NaCl 15g，延胡索酸铁2g，甘露醇1g，苯酚 10g，蛋白胨1g，饱和盐水65g。
首先以盐碱土壤为嗜盐菌菌源,在温度为40°C ，pH 8.5条件下用MGM培养基进行筛选培养3d，作为嗜盐菌菌源，冷藏保存;再以黄河水为细菌菌源，在温度37°C ，pH8.0条件下用苯酚培养基进行筛选培养24h，作为降酚细菌菌源，冷藏保存;然后把嗜盐菌放入饱和盐水中，电击8h，然后加热到70°C ，加热5min，得到混合液，待冷却后PEG沉降，去除沉淀，保留上清液;再用CaCl2溶液处理降酚细菌，然后把降酚细菌加入上清液中，涂抹于苯酚培养基上，在温度为37°C 条件下培养7d，作为转基因细菌菌源;最后把得到的转基因细菌涂抹于改良的苯酚培养基上在温度为40°C ，pH 8.5条件下培养3d筛选出转基因细菌。
用该转基因细菌在 ，pH 8.0条件下处理某工厂25%盐浓度含酚废水，废水内的酚浓度从100 mg/L降到0.01mg/L，去除率高达99.98%。
实例 3
MGM培养基以质量计，取牛肉膏0.3g，蛋白胨2g，NaCl 23g，琼脂 2g，CaCl2 0.2g,甘油2g，酵母提取物2g，饱和食盐水 68.5g。
苯酚培养基以质量计，取放线菌酚 1.5g，NaCl 3g，延胡索酸铁 3g，甘露醇 2g，苯酚 20g，蛋白胨 2g，饱和食盐水 68.5g。
改良苯酚培养基以质量计，放线菌酚 1.5g ，NaCl 17g，延胡索酸铁3g，甘露醇2g，苯酚 20g，蛋白胨2g，饱和盐水54.5g。
首先以盐碱土壤为嗜盐菌菌源,在温度为37°C ，pH 8.0条件下用MGM培养基进行筛选培养2.5d，作为嗜盐菌菌源，冷藏保存;再以黄河水为细菌菌源，在温度36°C ，pH7.5条件下用苯酚培养基进行筛选培养20h，作为降酚细菌菌源，冷藏保存;然后把嗜盐菌放入饱和盐水中，电击7h，然后加热到65°C ，加热4min，得到混合液，待冷却后PEG沉降，去除沉淀，保留上清液;再用CaCl2溶液处理降酚细菌，然后把降酚细菌加入上清液中，涂抹于苯酚培养基上，在温度为36°C 条件下培养7d，作为转基因细菌菌源;最后把得到的转基因细菌涂抹于改良的苯酚培养基上在温度为38°C ，pH 8条件下培养3d筛选出转基因细菌。
用该转基因细菌在36 °C，pH 7.5条件下处理某工厂23%盐浓度含酚废水，废水内的酚浓度从100 mg/L降到0.06mg/L，去除率高达99.98%。
