申请日2012.12.18
公开(公告)日2013.05.15
IPC分类号C12N1/20; C12N1/02; A61K35/74; A61K9/14; C12R1/125; A61P37/04; A61P1/14; A61P31/00; A23K1/16; A61P1/00
摘要
本发明为一种适应淀粉污水做培养基碳源的枯草芽孢杆菌的筛选和可湿粉制剂的生产方法。本发明所筛选枯草芽孢杆菌菌株(Bacillussubtilis)XWJLSP-1，已于2012年8月28日在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.6478。本发明所述的枯草芽孢杆菌XWJLSP-1可湿粉制剂的生产方法为：取淀粉污水、玉米浆、硫酸镁及碳酸钙粉制成发酵培养基;向培养基罐内通入无菌空气发酵培养;当培养液中的菌体数量达到1×1010·ml-1以上后，加入由硅藻土、羧甲基纤维素构成填充材料，减压蒸发到含水量为60%时进行喷雾干燥。
权利要求书
1.一种适应淀粉污水做培养基碳源的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus subtilis)XWJLSP-1，已于2012年8月28日在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.6478。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌XWJLSP-1的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养基的制备：
a.富集用液体培养基：玉米淀粉过程污水10-15% 、玉米浆1-15%(w/w)及 NaCl 10.0g/L、碳酸钙粉10-50g/L， pH 值 7.0~7.2，
b.分离培养基： 含有2% 琼脂的富集用液体培养基a ;
(2)菌种的分离：
a.取土壤溶液煮沸 10~30min，然后取100μL加入富集用液体培养基中，振荡培养 15-20h ;
b.取100ul富集后的培养液加入富集用液体培养基中，振荡培养 15-20h，重复2-10次;
c.将最后一次富集培养液103-109倍梯度稀释，用划线分离法在分离培养基上分离芽孢杆菌;
d.选取分离得到的菌落纯化、斜面保藏、鉴定。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌XWJLSP-1的可湿粉剂的生产方法，其特征在于，操作步骤和工艺条件如下：
(1)取淀粉污水10-15%、玉米浆0.5-1%、硫酸镁 0.5%(w/w)及碳酸钙粉20g/L制成发酵培养基;
(2)向培养基罐内通入无菌空气，通气量(VVm)为0.5-1.0，搅拌速度为100-300 r/min，培养温度为32-39 ℃;
(3)培养15-20小时，当培养液中的菌体数量达到1× 10 10· ml -1以上后，加入发酵液10%(w/v)的填充材料，所述填充材料由硅藻土90%、羧甲基纤维素10%构成;
(4)将发酵液减压蒸发到含水量为60%时，进行喷雾干燥得到成品枯草芽孢杆菌可湿粉制剂。
4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌XWJLSP-1的可湿粉剂的生产方法，其特征在于所说的发酵培养基中，淀粉污水含固量为5%-20%，玉米浆含量为5%-15%，硫酸镁含量为2%-5%(w/w)。
说明书
一种适应玉米淀粉污水 做培养基碳源的枯草芽孢杆菌筛选和可湿粉剂的生产方法
技术领域
本发明属于枯草芽孢杆菌菌种筛选和培养的技术领域，尤其涉及用玉米淀粉污水培养枯草芽孢杆菌的方法。
背景技术
微生态制剂是利用正常微生物成员和促进物质制成的微生物制剂，其具有补充或充实微生态系群落的内涵，维持或调整微生态平衡的作用。作为一种天然的生物活菌及生物活性物质，因具有无毒副作用、无留污染及不产生抗药性等优点而成为抗生素的替代品，并且越来越被人们所重视。微生态制剂与其他药物不同，能起到“已病辅治、未病防病、无病保健”重要作用。
我国农业部早在2003年就公布了能够用于生产微生态制剂的芽孢杆菌属菌种有枯草芽孢杆菌( Bacillussubtilis )、地衣芽孢杆菌( Bacilluslicheniformis )等 。
由枯草芽孢杆菌制备而成的微生态制剂具有如下优良特性：1)能调节动物肠道菌群平衡，改善肠道微生态环境，促进动物生长和提高抗病力。2)在不利环境条件下能以孢子形式存在，在饲料制粒、贮存及胃酸环境中仍能保持高活性。3)能刺激动物免疫器官的生长发育，激活淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高机体免疫力。4) 能自身合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等，与内源消化酶共同发挥作用，促进养分的消化吸收。5)能自身合成抗生素，抑制有害菌生长。
传统的枯草芽孢杆菌生产方法都要消耗大量的成品糖和淀粉等价格较高的工业产品，生产成本高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，筛选一种适应玉米淀粉污水做培养基碳源的枯草芽孢杆菌菌株，以及用其培养枯草芽孢杆菌的新方法。不仅降低了生产成本，而且达到了环保的目的。该方法所产产品益生活力高、安全可靠、完全符合国家标准(医药级标准)。
本发明提供的适应玉米淀粉污水做培养基碳源的枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XWJLSP-1，已于2012年8月28日在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.6478，
保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XWJLSP-1的筛选、培养方法如下：
1、筛选用培养基
( 1 ) 富集用液体培养基：玉米淀粉过程污水10-15%、玉米浆1-15%(w/w)，NaCl 10.0g/L，碳酸钙粉10-50g/L，pH 值 7.0～7.2，
( 2 ) 分离培养基： 富集用液体培养基中加入 2% 琼脂， ( 3 ) 生理生化鉴定培养基： 参考 《 常见细菌鉴定手册 》
2、 菌株的培养、分离、鉴定方法
(1)土壤溶液的制备
从西王玉米淀粉厂污水排出口附近、下水道内和西王污水处理厂爆气池附近及污水处理厂内的草地、林地分别取了土样。把上述土样混合均匀后取10g 土壤， 放入盛 90mL 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中， 振摇约 20min, 使土样与水充分混合，使细胞分散，待用。
(2)菌种的分离
取土壤溶液煮沸 10min～30in，然后取100 μL 加入富集用液体培养基中， 37 ℃、200r/min振荡培养15-20h。再取100μL富集后的培养液加入富集用液体培养基中，37 ℃、200r/min 振荡培养15-20h，这样反复做2-10次。把最后一次富集培养液进行103-109倍梯度稀释，用划线分离法在分离培养基上分离芽孢杆菌，选取疑似菌落纯化，斜面保藏，鉴定。
( 3)菌种的鉴定
与同样条件培养的标准枯草芽孢杆菌菌株比较 ,选择菌落与标准枯草芽孢杆菌菌株干燥型菌落相近的菌株编号进行镜检，革兰氏染色实验，取杆状、产芽孢革兰氏阳性的菌落进行各项生化反应鉴定(参考《伯杰氏细菌鉴定手册 》和《微生物学实验手册 》和《常见细菌鉴定手册》进行)，得到鉴定结果，列表对比。
试验项目 xwjlsp-1 xwjlsp-2 xwjlsp-3
厌氧生长试验 - + -
好氧生长试验 + + +
运动试验 + + +
葡萄糖产酸试验 + + +
淀粉酶试验 + + +
接触酶试验 + + +
7%氯化钠试验 + + +
10%氯化钠试验 - + +
52℃ +(但生长缓慢) - +(但生长缓慢)
6℃ +(但生长缓慢) +(但生长缓慢) -
pH 5.5 + _ -
柠檬酸钠产碱实验 + + +
马尿酸盐水解试验 - - -
硝酸盐还原试验 + + +
明胶分解试验 + + +
卵磷脂试验 - - -
V-p试验 + + +
硫化氢试验 - - -
阿拉伯糖产酸试验 + + +
木糖产酸试验 + + +
甘露醇产酸试验 + + +
注 :“ + ”表示阳性或生长 ,“ - ”表示阴性或不生长。
根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》，只有xwjlsp-1菌株的生理生化特征与标准枯草芽孢杆菌的特征完全一致，鉴定为枯草芽孢杆菌菌株。
(4)菌种益生潜质的鉴定
进行枯草芽孢杆菌与肠道微生物的生长竞争实验、蛋白酶活性实验、淀粉酶活性实验、净化污水能力等实验、动物饲养实验，确定该菌株具有优良的益生菌性质。
本发明所述枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XWJLSP-1可湿粉剂的生产方法为：
(1)取淀粉污水10-15%、玉米浆0.5-1%、硫酸镁 0.5%(w/w)及碳酸钙粉20g/L制成发酵培养基，所说的培养基中，淀粉污水含固量为5%-20 %，玉米浆含量为5%-15%，硫酸镁含量为2%-5%(w/w);
(2)向罐内通入无菌空气，通气量(VVm)为0.5-1.0，搅拌速度为100-300 r/min，培养温度为32-39 ℃;
(3)培养15-20小时，当培养液中的菌体数量达到1× 10 10· ml -1以上后，加入发酵液10%(w/v)的填充材料(硅藻土90%、羧甲基纤维素CMC-Na10%);
(4)将发酵液减压蒸发到含水量为60%时，进行喷雾干燥得到成品枯草芽孢杆菌可湿粉制剂。
本发明的有益效果是：所筛选菌种在以淀粉污水做碳源的培养基中比生长率高，可湿粉剂生产工艺简单，生产成本低，通过本工艺进行产品生产符合当前国家对企业节能环保的要求。
具体实施方式
实施例1：
按10%淀粉污水、1%玉米浆、硫酸镁 0.5%(w/w)及碳酸钙粉20g/L.制成培养基300ml，121℃下消毒20min, 接入2环菌种，设定培养温度为35℃，120rpm进行摇瓶培养，培养16h, 当培养液中的菌体数量达到1× 10 10 · ml -1以上后，加入发酵液10%(w/v)的填充材料(硅藻土90%，羧甲基纤维素CMC-Na 10%)，搅拌10分钟;将发酵液减压蒸发到含水量为60%时进行过滤、干燥、粉碎得到成品枯草芽孢杆菌可湿粉制剂。可制得枯草芽孢杆菌可湿粉制剂35g，经检测所制备的枯草芽孢杆菌xwjlsp-1可湿性粉剂芽孢含量为2.3×1010 cfu/g，pH值6.9，水分含量2.89%，悬浮率83%，润湿时间45 s，细度通过率99.1%，各项检测结果均符合国家标准。
实施例2：
按12%淀粉污水、1%玉米浆、硫酸镁 0.5%(w/w)及碳酸钙粉20g/L制成培养基6000ml，121℃，消毒20min,加入发酵罐，按培养液体积的1%接入培养好的种子，向罐内通入无菌空气，通气量(VVm)为0.5-1.2，搅拌速度为100-300 r/min，培养温度为32-39 ℃;培养18h, 当培养液中的菌体数量达到1× 10 10· ml -1以上后，加入发酵液10%(w/v)的填充材料(硅藻土90%，CMC-Na(羧甲基纤维素钠)10%)，搅拌10分钟;将发酵液减压蒸发到含水量为60%时进行过滤、干燥、粉碎得到成品枯草芽孢杆菌可湿粉制剂。可制得枯草芽孢杆菌可湿粉制剂600g，经检测所制备的枯草芽孢杆菌xwjlsp-1可湿性粉剂芽孢含量为2.1×1010 cfu/g，pH值6.78，水分含量3.89%，悬浮率81%，润湿时间46 s，细度通过率99.3%，各项检测结果均符合国家标准。
实施例3：
按15%淀粉污水、0.5%玉米浆和硫酸镁 0.3%(w/w)及碳酸钙粉20g/L制成培养基100升，121℃，消毒20min,加入发酵罐，按培养液体积的1%接入培养好的种子，向罐内通入无菌空气，通气量(VVm)为0.5-1.0，搅拌速度为100-200 r/min，培养温度为32-39 ℃;培养16h, 当培养液中的菌体数量达到1× 10 10· ml -1以上后，加入发酵液10%(w/v)的填充材料(硅藻土90%，CMC-Na(羧甲基纤维素钠)10%)，搅拌10分钟;将发酵液减压蒸发到含水量为60%时进行喷雾干燥得到成品枯草芽孢杆菌可湿粉制剂。可制得枯草芽孢杆菌可湿粉制剂10kg，经检测所制备的枯草芽孢杆菌xwjlsp-1可湿性粉剂芽孢含量为2.6×1010 cfu/g，pH值7.3，水分含量3.68%，悬浮率81%，润湿时间48 s，细度通过率99.2%，各项检测结果均符合国家标准。
与普通枯草芽孢杆菌菌种的比较
对比例1
本实验室从邹平县韩店仁和堂药店购得“天悦婷”枯草芽孢杆菌活菌胶囊，通过葡萄糖碳源的分离培养基分离得到枯草芽孢杆菌tytsp-1用于与xwjlsp-1菌种比较。
按10%淀粉污水、1%玉米浆和硫酸镁 0.5%(w/w)及碳酸钙粉20g/L制成培养基300ml，121℃，消毒20min, 接入2环tytsp-1菌种，设定培养温度为35℃，120rpm进行摇瓶培养，培养16h后, 培养液中的菌体数量只有2× 10 9 · ml -1，再培养2小时，总培养时间为18h后，培养液中的菌体数量没有显著变化，只有2.63× 10 9 · ml -1总培养时间为20h后，培养液中的菌体数量为2.6× 10 9 · ml -1 加入发酵液10%(w/v)的填充材料(硅藻土90%，CMC-Na(羧甲基纤维素钠)10%)，搅拌10分钟;将发酵液减压蒸发到含水量为60%时进行过滤、干燥、粉碎得到成品枯草芽孢杆菌可湿粉制剂。可制得枯草芽孢杆菌可湿粉制剂35g，经检测所制备的枯草芽孢杆菌tytsp-1可湿性粉剂芽孢含量为0.6×1010cfu/g，pH值6.9，水分含量3.29%，悬浮率81%，润湿时间44 s，细度通过率99.3%。
对比例2
本实验室从邹平县韩店镇源华药店购得“天悦婷”枯草芽孢杆菌活菌胶囊，通过葡萄糖碳源的分离培养基分离得到枯草芽孢杆菌tytsp-2用于与xwjlsp-1菌种比较。
按12%淀粉污水、1%玉米浆和硫酸镁 0.5%(w/w)及碳酸钙粉20g/L制成培养基6000ml，121℃，消毒20min,加入发酵罐，按培养液体积的1%接入培养好的种子，向罐内通入无菌空气，通气量(VVm)为0.5-1.2，搅拌速度为100-300 r/min，培养温度为32-39 ℃;培养16h后, 培养液中的菌体数量只有1.8× 10 9 · ml -1，再培养2小时，总培养时间为18h后，培养液中的菌体数量没有显著变化，只有2.30× 10 9 · ml -1总培养时间为20h后，培养液中的菌体数量为2.36× 10 9 · ml -1 ，加入发酵液10%(w/v)的填充材料(硅藻土90%，CMC-Na(羧甲基纤维素钠)10%)，搅拌10分钟;将发酵液减压蒸发到含水量为60%时进行过滤、干燥、粉碎得到成品枯草芽孢杆菌可湿粉制剂。可制得枯草芽孢杆菌可湿粉制剂600g，经检测所制备的枯草芽孢杆菌tytsp-2可湿性粉剂芽孢含量为0.56×1010cfu/g，pH值6.78，水分含量3.59%，悬浮率83%，润湿时间46 s，细度通过率98.3%。
