内分泌干扰物被定义为一类能够干扰或抑制生物体内分泌、神经、免疫和生殖系统功能, 并产生可逆或不可逆性生物学效应的外源性物质.在自然界中内分泌干扰物以多种形式存在，据报道超过8 700种物质具有内分泌干扰效应.内分泌干扰物主要包括固醇类激素、表面活性剂、工业合成物等.例如，雌酮 (E1)、雌二醇 (E2)、雌三醇 (E3) 是人和动物排泄物中主要的天然雌激素. 17α-乙炔基雌二醇 (EE2) 作为口服避孕药的主要成分，则是合成类固醇激素的主要形式.由于污水处理工艺并不能将内分泌干扰物完全去除，污水处理厂出水成为自然水体中内分泌干扰物的主要来源之一.另外，由于内分泌干扰物具有一定的亲脂性，其很容易在水生生物和低泥中富集，给水生生物带来一定的危害.一些研究表明水环境中的内分泌干扰物可导致鱼类体内卵黄原蛋白上升、雄鱼雌性化等.因此，检测城市污水的雌激素水平和干扰效应，并分析研究不同处理工艺的去除效果，对水环境的生态安全评价具有重要意义.
通常，人们采用化学分析法对水环境中雌激素物质进行定性或者定量分析，例如高效液相色谱、气相色谱、高效液相色谱-质谱法等.但这些化学分析法需要较高的成本和熟练的操作技能.此外，水环境的雌激素物质会产生拮抗、协同或者加和作用，而化学分析法无法反映化合物之间的相互作用，故其不能表明水环境雌激素物质的潜在效应.生物检测可反映水环境中化合物的综合生物效应.因此，有必要利用生物毒性检测法对水环境的雌激素效应进行评价.重组酵母菌法是常用的检测水环境雌激素活性的手段.其基本原理是雌激素物质能够和酵母菌携带的人体雌激素受体形成复合物，通过促进报告基因LacZ的表达，产生β-半乳糖苷酶，测定β-半乳糖苷酶的活性即可反映样品的雌激素活性，它具有灵敏度高、省时、成本低等优点.重组酵母菌法被广泛用于水样、污泥、底泥以及家庭灶炉等燃烧过程中排放的污染物的雌激素活性.酶联免疫吸附法 (enzyme linked immunosorbent assay，ELSIA) 则是基于抗原-抗体的特异性反应的原理，通过酶作用于底物后的显色来进行定量.传统上其主要用来检测细胞和血液中雌激素含量.酶联免疫吸附法需要的样品量少，不需要复杂的预处理，具有操作简单、节约时间和成本、可用于多种毒性指标检测的优点.目前，ELISA逐渐被用于水环境、土壤和低泥中雌激素物质的检测.因此，本研究的主要目的是利用重组酵母菌法和酶联免疫法分别对不同处理工艺的生活污水的雌激素活性和E2水平进行检测和评价，并将两个检测方法进行比较，以期为进一步保障受纳水体的生态安全提供理论依据.
1 材料与方法1.1 实验试剂
雌二醇 (E2) 以及邻硝基酚β-D-半乳糖苷 (ONPG) 购自Sigma公司. SD培养基 (Synthetic dropout medium) 所需的硫酸腺嘌呤购于美国MP公司，葡萄糖购于阿拉丁.无氨基酵母氮碱、DO、SD/-Leu/-His所用的各种氨基酸购于Difco公司.二甲基亚砜 (DMSO)、HPLC级甲醇和乙酸乙酯购于天津科密欧公司. ELISA检测试剂盒购于德国DRG (EIA-2693).
1.2 样品采集和前处理
2015年8~10月分别对3个污水处理厂 (A、B、C) 各流程出水进行采集.水样的采集及标号如下：A-1~A-6依次为以氧化沟工艺为主的A污水处理厂对应处理单元的出水，A-S为氧化沟污泥样品;B-1~B-6依次为以A2/O工艺为主的B污水处理厂对应处理单元的出水，B-S为好氧污泥样品;C-1~C-3依次为以A2/O+MBR为主的C污水处理厂主要处理单元的出水，C-S1和C-S2分别为好氧池污泥和MBR膜池污泥样品.各污水厂处理流程及采样点如图 1所示.
图 1 各污水处理厂主要工艺流程及采样点
每个采样点采集2 L水样或1 L污泥混合液放入对应编号的棕色玻璃瓶中，并立即带回实验室.水样经玻璃纤维膜 (0.7 μm, Millipore, GF/B) 过滤后用HLB柱子 (Oasis HLB 200 mg Cartridge, Waters) 富集.具体操作如下：依次用10 mL乙酸乙酯、10 mL甲醇和10 mL超纯水活化HLB柱子.取调节pH为3的水样2 000 mL以10 mL ·min-1的流速过柱，随后用10 mL超纯水-甲醇 (9:1) 洗柱，继续真空干燥1 h.最后用10 mL乙酸乙酯以1 mL ·min-1流速洗脱到10 mL的试管中，40℃水浴下用微氮气吹干.萃取物用1 mL DMSO进行溶解，均分成两份，一份用DMSO梯度稀释用于雌激素活性检测，另一份用超纯水稀释100倍用于ELISA (E2) 检测.
污泥混合液经中速定性滤纸过滤后，收集滤纸上污泥，真空冷冻干燥2~3d.之后准确称取1.0 g污泥并研磨成粉状.将研磨好的污泥放入10 mL磨口俱塞试管中，进行超声萃取4次，萃取剂分别为5 mL甲醇、5 mL甲醇、2×3 mL丙酮，每次萃取时间为15 min.每次萃取完，上清液经0.45 μm针头式样品PTFE过滤器过滤后用氮气吹至500 μL，加入超纯水，并用超纯水多次洗涤定容至500 mL.固相萃取步骤同水样.
1.3 重组酵母菌检测
雌激素活性采用中科院生态环境中心建立的酵母双杂交雌激素活性评价方法.每个样品按梯度稀释8个浓度 (浓缩液稀释倍数：1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128).将酵母菌置于SD培养基中，在30℃、130 r ·min-1条件下培养36 h.用SD培养液稀释菌液至其在600 nm的吸光度值为0.75左右，吸取菌液995 μL于1.5 mL灭菌离心管中，加入5 μL稀释的样品并混匀，每个浓度设置3个平行.将200 μL的混合菌液转移到96孔板中，在30℃、800 r ·min-1条件下暴露4 h.测定菌悬液在600 nm的吸光度值，随后每孔弃去150 μL，加入120 μL测试缓冲液和20 μL氯仿，于1 200 r ·min-1振荡破壁15 min，加入40 μL ONPG，于30℃、800 r ·min-1下培养显色60 min.显色结束后，每孔加入100 μL碳酸钠溶液，终止反应.吸取上清液200 μL至新96孔板中，测定420 nm处吸光度.同时，以DMSO做阴性对照，以E2为阳性对照. β-半乳糖苷酶活性 (U) 按公式 (1) 计算.
式中，t为加入ONPG到溶液显色时的反应时间，60 min;V为菌液体积，0.2 mL;A600、A420分别为菌液在600 nm、420 nm处的光密度值;A′420为空白对照在420 nm处的光密度值;D为稀释因子6.6.
由剂量效应曲线得出β-半乳糖苷酶活性后，根据最小二乘法如公式 (2) 计算水样的EC50.
式中，y为β-半乳糖苷酶活性;X为水样浓缩倍数;A为最大β-半乳糖苷酶活性;B为回归曲线中点的斜率;C为半数最大β-半乳糖苷酶活性时水样的浓缩倍数 (EC50);D为本底β-半乳糖苷酶活性.
对于样品的雌二醇当量用EEQ表示，计算方法根据公式 (3).
1.4 酶联免疫吸附检测 (ELSIA-E2)
取25 μL标准品 (试剂盒中自带的E2的标准溶液分别为0、25、100、250、500、1 000、2 000 ng ·L-1)、质控品 (实验室自配的E2浓度：200 ng ·L-1) 和浓缩的样品加入相应微孔中.在每一微孔中加入200 μL酶联物，充分混匀10 s，室温孵育120 min.快速弃去孔内反应物，每孔用400 μL洗涤液洗板3次，在吸水纸上拍干.每一微孔中加入100 μL底物液，室温孵育15 min.加50 μL终止液到每个检测孔中终止酶反应，在10 min之内测定450 nm的吸光度值.所有的标准品、质控品和样品设置3个平行.按照以上步骤对E2标准溶液进行测定，并以每个浓度的吸光度的平均值作为此浓度的吸光度B.用公式 (4) 计算吸光率.以浓度对数lgc对吸光率对数lg (B/B0) 绘制标准曲线图.
式中，A450为450 nm处的吸光度;空白为0 ng ·L-1的E2.
2 结果与讨论2.1 污水中雌激素活性的分析
以DMSO为溶剂配置一系列E2标液，按上述方法测定β-半乳糖苷酶诱导活性值，得出E2的剂量-活性效应关系如图 2所示.从中可以得出E2的EC50为6.73×10-11 mol ·L-1，与马军等[15]的研究结果 (5.95×10-11 mol ·L-1) 具有一致性，说明了该方法的可行性.
图 2 E2的雌激素活性剂量-效应曲线
各污水处理厂主要单元出水的雌激素活性如图 3所示. A、B和C污水处理厂进水均表现出较强的雌激素活性，EEQ分别为7.58、7.29、4.35 ng ·L-1. C污水处理厂进水的EEQ低于其它两个污水处理厂.产生这种现象的原因可能是污水来源不同，C污水处理厂污水来源是校园污水，污水成分简单，而其余两个污水处理厂污水来源则是城市污水，承接污水比较广泛，雌激素活性较强. Shore等也指出污水来源影响污水厂进水的雌激素活性.经氧化沟工艺、A2/O工艺和A2/O+MBR工艺处理之后，出水的EEQ降低为2.19、1.89、1.06 ng ·L-1.孙庆峰等采用ER-CALUX方法将雌激素活性作为饮用水水质指标时，得出最大无剂量效应的EEQ为0.4 ng ·L-1.因此，本研究中的3个污水厂出水仍具有很高的风险性.
图 3 雌激素当量 (EEQ) 和去除率在各工艺中的变化
由图 3(A)和3(B)可知，曝气沉砂池单元对雌激素活性的去除能力非常有限，去除率≤11%.这可能是由于曝气沉砂池主要用于去除污水的无机颗粒物、油脂类以及少量的有机污染物等;另一方面，雌激素物质，如E1、E2、E3和EE2，具有较低的亨利常数，在常温常压下很难挥发，导致曝气作用对雌激素活性的去除效果不佳.由图 3(B)可以看出污水经初沉池处理之后，雌激素活性基本没有变化.初沉池主要是通过重力沉降作用去除大颗粒物质，而污水的雌激素物质主要存在于液相，单纯的物理沉降作用无法显著降低污水的雌激素活性.
对比3个污水处理厂的主要工艺发现，雌激素活性的降低主要依赖污水处理的氧化沟工艺、A2/O工艺和A2/O+MBR工艺.经过这些工艺处理之后，EEQ分别降低71.10%、74.07%和75.54%.另外，3个污水处理厂出水的氨氮浓度均低于5 mg ·L-1，达到一级A排放标准，总磷的浓度低于1 mg ·L-1，达到一级B排放标准.这说明3个污水厂的生物处理单元具有良好的脱氮除磷效果和较好的菌落结构.而固醇类雌激素如E1、E2、E3和EE2主要是通过氨氧细菌共代谢作用和异养菌作用得到降解，当污水处理过程中具有良好的硝化作用时，这些物质可得到很好地去除.例如，Khunjar等指出氨氧化菌将EE2降解为某中间产物如羟基EE2，而异养菌可将EE2的中间产物继续降解为更简单的结构甚至碳化.同时，本实验检测到3个污水处理厂活性污泥的雌激素活性，如图 4所示.氧化沟污泥、A2/O工艺好氧池污泥、A2/O+MBR工艺的好氧池污泥和MBR膜池污泥的EEQ分别为1.84、1.85、2.16、2.43 ng ·g-1.物质的lgkow值决定了其与污泥的吸附能力，当化合物的lgkow介于2.5~4.0时表现出中度的吸附能力;大于4.0时，表现出高的吸附能力.而水环境中主要的雌激素物质如E1、E2、E3和EE2的lgkow分别为3.43、3.94、2.81和4.15.因此，活性污泥可通过吸附作用去除部分的雌激素活性.
图 4 各污水处理厂污泥样品的雌激素当量
由图 3(A)和3(B)可知加氯消毒之后，污水出水的雌激素活性基本没有变化.这可能由于消毒过程产生的消毒副产物具有一定的雌激素活性，导致出水的EEQ比较恒定.一些研究指出E1、E2和EE2的消毒副产物，如2, 4二氯雌酮、2, 4二氯雌二醇以及4-氯乙炔雌二醇，具有和母体相当的雌激素活性.由图 3(c)看出，经MBR处理之后，污水的EEQ降低了22.62%.膜生物反应是结合膜分离和生物处理方法的处理技术，能够强化有机物的去除.
2.2 酶联免疫吸附法 (ELISA) 检测E2的浓度
以E2浓度对数lgc和吸光率对数lg (B/B0) 作标准曲线，线性回归方程为：
该方程的相关系数为0.989.根据标准曲线得到各污水处理厂主要工艺出水的E2浓度，如图 5所示.从中可知，A、B和C污水厂进水中E2浓度分别为64.83、83.43和36.95 ng ·L-1.以校园污水为来源的C污水处理厂进水的E2浓度低于其余两个污水厂，该结果和雌激素活性具有一致性. B污水处理厂经曝气沉砂池和初沉池处理之后，E2的浓度并没有明显的降低. 3个污水厂进水分别经氧化沟工艺、A2/O工艺和A2/O+MBR工艺处理之后，污水厂出水E2的浓度分别为6.47、16.82、4.48 ng ·L-1.
图 5 各工艺流程出水中E2的浓度
生物处理阶段对E2的去除起着主导作用.氧化沟工艺、A2/O工艺和A2/O+MBR对E2的去除率分别为75.88%、77.84和80.72%. B污水处理厂对E2的去除效果稍高于A污水厂，这可能是由于E2在厌氧、缺氧和好氧条件下均可以被微生物降解，而A2/O工艺具有延长生物处理作用的特点.另外，良好的硝化过程有利于雌激素的去除，A2/O工艺的脱氮除磷效果高于氧化沟工艺. C污水厂二级出水经MBR工艺处理后，E2的浓度降低37.16%，这可能是MBR单元具有良好的泥水分离效果，使污泥浓度增大，微生物活性增强，强化了有机物的去除.由图 5可知，加氯消毒对E2的去除效果并不明显.加氯消毒的效果与消毒剂量有关，而市政污水存在较多消毒副产物的前驱物如腐殖质、富里酸和腐殖酸等影响加氯消毒对E2的去除.此外，A、B和C污水处理厂活性污泥中E2含量分别为11.70、12.84、9.8和8.45 ng ·g-1，如图 6所示.如前所述，E2具有一定的亲脂性，容易被污泥吸附.雌激素物质被污泥吸附之后，通过污泥回流进一步实现脱附和降解，但最终通过剩余污泥带走的雌激素总量不超过进水的5%.因此，污泥对E2的去除效果是微弱的.
图 6 各污水处理厂污泥样品中E2的含量
2.3 重组酵母菌法和酶联免疫法的比较
将用ELISA检测的E2值与用酵母菌法检测的EEQ相比，ELISA检测的E2值偏低. Välitalo等研究也发现ELISA检测的水体目标物浓度水平 (E2) 比ERα-CALUX®检测的EEQ要高.环境水样中存在和E2结构非常相似的其他雌激素，如E1、E3和EE2.这些物质可以与微孔板上包被的E2抗体发生交叉反应，从而使ELISA检测结果偏高.另一方面，由于污水成分复杂，一些抗雌激素物质的存在以及物质之间存在拮抗作用，可导致检测的雌激素活性相应较低.因此，两种检测结果具有一定的差异性.通过统计学对ELISA检测的E2值和酵母菌检测的EEQ进行分析，得出两者具有很好的一致性，如图 7，相关系数为0.837.这表明两指标在结果评价上整体趋势的一致，ELISA检测技术为水环境雌激素的快速筛选和诊断提供了一个新方法.具体参见污水宝商城资料或http://www.dowater.com更多相关技术文档。
图 7 样品的EEQ与E2的浓度水平的相关关系
3 结论
(1) 原污水的雌激素活性雌二醇当量为4.35~7.58 ng ·L-1，出水中雌二醇当量降至1.06~2.19 ng ·L-1，去除率为71.10%~75.54%.雌激素活性的去除主要发生在生物处理阶段，如氧化沟和A2/O处理单元.
(2) 原污水的E2浓度为36.95~83.43 ng ·L-1，氧化沟、A2/O和A2/O+MBR处理单元对E2具有很好的去除效果，去除效能分别为75.88%、77.84和80.72%，MBR工艺能够强化E2的去除.
(3) 污泥中雌二醇当量和E2的含量分别为1.84~2.43 ng ·g-1和8.45~12.84 ng ·g-1，污泥可通过吸附作用去除一定的雌激素活性和E2.
(4) 酶联免疫法与酵母菌法具有很好的一致性，并为水环境雌激素的快速筛选和诊断提供了一个新的方法.
