造纸工业是环境污染大户，生产过程中化学制浆、洗浆、漂白以及抄纸工序会产生大量的废水。化学制浆产生的黑（红）液废水与抄纸白水，可通过常规的碱回收工艺以及气浮、过滤等处理后直接回用于生产。洗浆、漂白段产生的中段废水污染物成份复杂，除含有高浓度的较难生物降解的木质素、纤维素外，还含有对环境危害极大的低分子量氯代酚和色度很高的高分子量氯代木素衍生物、糖类、残碱、无机盐、挥发酸等，这段废水COD高、pH变化幅度大、色度高、可生化性差，处理难度大，是真正意义上的造纸废水。当前，采用常规的一级沉降与二级生化处理后，造纸废水的污染负荷大幅降低，虽然也达到了外排标准，但水的色度与COD值仍然较高，水中仍含有一定量毒性很高的可溶性木素衍生物与多酚类物质，不仅达不到回用标准，外排还会对生态环境造成极大危害，因此，研究造纸废水的深度处理就显得非常必要。
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，参与木素的降解或聚合，具有氧化木素的能力。在有氧条件下，漆酶能使造纸废水中的木素衍生物和多酚类化合物发生氧化降解或聚合，进而通过絮凝沉淀或深度氧化除去，基于此，近年来用漆酶及产漆酶白腐菌深度处理造纸废水成为研究热点并取得了良好的效果。裂褶菌是一种珍贵的食、药两用真菌，研究证明，裂褶菌能分泌高活性的漆酶，而且裂褶菌漆酶在对纺织品染料进行脱色以及废新闻纸的脱墨方面表现出良好的应用效果，但有关裂褶菌漆酶应用于造纸废水处理方面的文献并未见报道。
本文在前期筛选到一株产漆酶裂褶菌mys005并通过液体发酵培养得到了高活力漆酶的基础上，主要开展裂褶菌mys005漆酶的酶学特性及深度处理造纸废水最佳工艺条件研究，以期为其工业化应用积累数据并为应用企业提供参考。
1、材料与方法
1.1 产漆酶菌种
采自秦岭骊山，在愈创木酚-PDA培养基平板上产生深棕红色变色圈，在α-萘酚PDA培养基平板上不产生变色圈；真菌ITS分子鉴定为裂褶菌（Schizo⁃phyllumcommuneFr.）,所内编号mys005。
造纸废水取自陕西某废纸制浆造纸厂综合废水经生化处理后的二沉池出水（废水水质：木素121mg/L，色度（倍）238，COD304mg/L，pH6.7）。
1.2 药品、仪器与设备
实验所用到的药品均为分析纯（天津百世化工）与生化级试剂（北京奧博星）；ABTS（2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐）为Sigma试剂；HBT（1-羟基苯并三唑）购自国药集团试剂公司；BeckmanDU640紫外分光光度计；愠温摇床：KYC-1102上海新苗医疗器械有限公司；愠温培养箱：PYS-DHS上海跃进医疗器械厂；恒温水浴箱：HH•W21•600S上海跃进医疗器械厂。
1.3 方法
1.3.1 漆酶液的制备
mys005斜面菌种用PDA平板活化2~3d后无菌操作打成￠6mm菌饼，接入摇瓶（500mL锥形瓶装培养液150mL，接菌饼5片/瓶），于30℃摇床200r/min培养9d，发酵液先用脱脂棉过滤然后再于10000r/min离心10min得漆酶液。摇瓶培养基（20%马铃薯滤汁1000mL、K2HPO4•3H2O1.00g、NaCl0.50g、MgSO4•7H2O0.50g、NaNO32.50g、CaCl2•2H2O0.10g、FeCl30.02g、吐温-801.20mL，微量元素复合液（50mg/mLCuCl2•2H2O+20mg/mLMnSO4•7H2O+10mg/mLZnSO4•7H2O）3mL、洋葱100g（切碎）、麦麸10g），pH4.5，121℃灭菌20min。
1.3.2 漆酶活测定方法：ABTS法
酶活定义：以每min转化1μmol/LABTS的酶量为一个酶活单位（U）。
1.3.3 漆酶酶学特性研究
1.3.3.1 漆酶最适反应温度
用1.3.2节方法，选择在不同温度下测定酶活，活力最高者为100%。
1.3.3.2 漆酶最适反应pH
用1.3.2节方法，选择用不同pH的醋酸—醋酸钠缓冲液测定酶活，活力最高者为100%。
1.3.3.3 漆酶的热稳定性
取酶液在不同温度下分别保温不同时间，然后迅速冷却到室温，用1.3.2节方法测定酶活，以30℃测定的未保温处理酶样的酶活为100%。
1.3.4 漆酶处理造纸废水研究
1.3.4.1 废水处理方法
取200mL废水样于500mL锥形瓶中，调节pH，加入适量的漆酶液及介体HBT与水样混匀，置于恒温水浴进行处理，期间不间断摇匀水样，处理完成后将水样用6层纱布过滤，收集上清液用于测定木素含量、COD及色度，计算降解率。
1.3.4.2 废水木素含量的测定
由于木素的紫外吸收光谱在280nm处有特征吸收峰，因此，可以在波长280nm下定量地测定水样中木素的含量（浓度）。计算公式如下：
式中：A为吸光度；a为吸收系数，此水样吸收系数采用26.1L/（g•cm）；b为比色皿的厚度1cm；c为测定水样中木素吸收浓度，g/L。
木素降解率（%）=×100
1.3.4.3 废水COD和色度的测定
COD的测定采用重铬酸钾法（GB/T11914-1989）。色度测定采用稀释倍数法（GB/T11903-1989）。
COD降解率（%）=×100
色度降解率（%）=×100
2、结果与分析
2.1 裂褶菌mys005漆酶酶学特性
由于不同菌种来源的漆酶具有其不同的最适反应温度、最适pH、酶的热稳定性等酶学特性，应用时要使酶发挥最佳催化效率，取得最佳处理效果，就有必要先对其酶学特性进行研究。
2.1.1 mys005漆酶最适反应温度
将酶反应温度分别设定为30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃测定漆酶活，以酶活力最高者为100%。结果如图1，裂褶菌mys005漆酶最适反应温度为70℃，适宜反应温度范围为65~75℃。
2.1.2 mys005漆酶最适反应pH
分别配制pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的醋酸—醋酸钠缓冲溶液用于测定酶活，以酶活力最高者为100%。结果如图2，可以看出mys005漆酶最适反应pH为4.5，同时可看出mys005漆酶具有较宽的pH反应范围，在pH3.5~5.5间，mys005漆酶均能保持比较高的活性，这将大大有利于该漆酶的工业化应用。
2.1.3 mys005漆酶的热稳定性
将漆酶液在40、50、60、70、80℃下分别保温30、60、90、120min后测定酶活，以30℃测定的未进行热处理所测酶活为100%。结果如图3，可看出mys005漆酶在低于50℃下具有良好的热稳定性，酶液在40℃保温2h仍有92%的活力，在50℃保温2h酶活保存率仍达83%，但当处理温度达到60℃时，酶活损失较快，保温2h酶活损失了53%，当处理温度高于70℃时酶开始迅速失活，高于80℃时，保温处理30min酶活损失至0。另外，由图3可见：在40~50℃下，保温30min，酶活反而增加了20%左右，这一结果与有关报道中热激对漆酶活有促进作用相一致。综合考虑漆酶的活性和热稳定性，确定mys005漆酶的使用温度不要超过60℃，以40~50℃为最佳。
2.2 mys005漆酶深度处理造纸废水
2.2.1 mys005漆酶处理废水最佳处理温度与最佳处理时间的确定
因为mys005漆酶的适宜反应pH范围为3.5~5.5，最适使用温度范围为40~50℃，故此处初步设定酶处理废水的pH值为5.0。
取4份200mL的水样，用稀HCl调水样pH为5.0，加入漆酶液使反应体系中酶的终浓度为50U/mL，加入介体HBT5mg/L，设定40、45、50、55℃不同温度进行处理，测定不同处理时间（1、2、3、4、5、6h）后各水样中木素含量、COD和色度值，计算降解率，以此确定最佳处理温度与处理时间。结果如图4~6所示。
从图4、5、6中可以看出，在pH5.0，处理温度40~55℃的范围内，mys005漆酶都能有效降低废水的木素与COD含量，总的趋势是：从40~50℃，处理温度越高，木素、色度与COD的降解率越高，用时越短，其中以50℃处理效果最好，处理4h，木素、色度及COD的降解率分别达到了72.3%、79.1%和59.3%。而当处理温度为40℃时，由于温度偏低，降解速率较慢，处理6h后，木素、色度及COD的降解率分别仅为52.7%、55.3%和41.4%；当处理温度为55℃时，由于超出了酶的最适反应温度，漆酶失活较快，处理3h后木素、色度及COD的降解率基本已接近最高值，其后虽然延长了处理时间，但降解率增值非常有限，最终处理效果远低于50℃时的效果。因此，确定mys005漆酶处理废水的最佳温度与时间分别为50℃与4h。
2.2.2 mys005漆酶处理废水最佳pH的确定
取6份200mL的水样，分别用稀HCl调整水样pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，加入漆酶液使反应体系中酶的终浓度为50U/mL，加入介体HBT5mg/L,调恒温水浴为50℃,反应4h后测定各水样中木素含量、COD和色度值，计算降解率，以此确定处理废水的最佳pH。结果如图7所示。
由图7可看出，从pH4.0~6.5，随着处理体系pH的上升，废水中木素、色度与COD的降解率都是先上升后下降，三者都在pH5.0时达到最高值，分别为74.2%、79.9%与59.8%。同时还可看出当处理pH为4.5与5.5时，虽然木素、色度与COD的降解率不如pH5.0时高，但数值相差不大非常接近。综合考虑因废水样的pH为6.7，为了减少调整pH所用酸的加入量，最终选择处理废水的最佳pH为5.5。
2.2.3 mys005漆酶处理废水最佳酶用量的确定
取5份200mL的水样，用稀HCl调pH为5.5，调恒温水浴50℃,加入介体HBT5mg/L,加入漆酶液使反应体系中酶的终浓度分别为30、40、50、60、70U/mL，反应4h后测定各水样中木素含量、COD和色度值，计算降解率，以此确定处理废水的最佳酶用量。结果如图8所示。
由图8可看出，酶用量对废水处理效果有较大影响，开始随着漆酶用量的增加，处理效果不断变好，废水中木素、色度与COD的降解率持续上升，但当酶用量达到40U/mL时，即使再增加酶的用量，三者的降解率增加却不再明显，据此确定漆酶的最佳用量为40U/mL，此时木素、色度与COD的降解率分别为74.1%、78.0%与57.2%。
2.2.4 mys005漆酶处理废水最佳HBT用量的确定
漆酶介体是一类特殊的小分子物质，它与漆酶共同构成漆酶—介质体系(Laccase-MediatorSystem，LMS)，通过间接提高漆酶的氧化还原电势和减少漆酶与底物之间的空间阻碍等方式提高漆酶对目标底物的催化氧化效率。HBT(一羟基苯并三氮唑)是一种常见的人工合成的漆酶催化氧化介体物质，它具有N-OH基，做为漆酶介体时会产生氮氧自由基，夺取底物上的氢，形成苄基自由基，使底物化学键断裂，从而提高漆酶的催化效率。有研究证明，白腐菌漆酶—HBT介体体系能对造纸废水进行有效处理；介体HBT能辅助漆酶降解蒽，漆酶与ABTS、HBT组成的复合介体系统能对菲进行氧化。
取7份200mL的水样，用稀HCl调pH5.5，调恒温水浴50℃,加入漆酶液使反应体系中酶的终浓度为40U/mL，分别加入介体HBT0、2、4、5、6、7、8mg/L进行处理，4h后测定各水样中木素含量、COD和色度值，计算降解率，以此确定处理废水的最佳HBT添加量。结果如图9所示。
由图9可看出，添加介体HBT能大幅提高mys005漆酶处理废水中木素、色度及COD的降解率，当反应体系不添加HBT时，废水木素、色度与COD的降解率分别仅为18.7%，23.1%和14.6%；添加介体HBT后，随着HBT用量的增加三者的降解率呈现出先快速上升而后趋于稳定的趋势，其中当HBT用量为6mg/L时，处理效果达到最佳，此时木素、色度及COD的降解率分别达到了77.8%，80.7%，60.7%。故此确定介体HBT的最佳用量为6mg/L。
2.2.5 mys005漆酶处理造纸废水放大验证实验
取3份2000mL的水样，用稀HCl调pH5.5，调恒温水浴50℃，分别加入漆酶液与介体HBT使各自反应体系中酶与HBT的终浓度分别为40U/mL与6mg/L，开始反应，4h后测定各水样中木素含量、COD和色度值，计算降解率。结果如表1所示。
由表1放大验证实验结果可以看出，mys005漆酶能够对造纸厂二沉池废水进行有效的深度处理，在合适的处理条件下，处理废水的木素、色度及COD的降解率分别达到了77.5%、81.1%和61.1%。
3、小结
（1）裂褶菌mys005漆酶最适反应pH为4.5，且在pH3.5~5.5间酶活稳定性良好；最适反应温度为70℃；在低于50℃下具有良好的热稳定性，使用温度以40~50℃为最佳，不要超过60℃。mys005漆酶与其它真菌漆酶一样属于一种酸性酶，但与其它白腐真菌来源的漆酶比较，其具有较宽的pH应用范围、较高的最适反应温度与较好的热稳定性，这都大大便利于其储存运输及工业化实际应用。
（2）裂褶菌mys005漆酶能对废纸造纸厂经生化处理后的二沉池废水进行有效深度处理，其中处理温度、处理时间、pH、酶用量及介体用量都会对处理效果产生重要影响；当处理温度为50℃，pH5.5，酶用量40U/mL，HBT用量6mg/L，处理4h后，废水的木素、色度与COD的降解率分别达到了77.5%、81.1%和61.1%，表现出了较好的工业应用潜力。（来源：陕西省生物农业研究所，陕西省酶工程技术研究中心，中国科学院西北生物农业中心）
