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BOD5测定通常采用标准稀释与接种法（GB 7488--87），其操作为，经中和及除去毒性物质并经稀释后的水样（必要时加入适量含好氧微生物的接种液）置入培养瓶中，于在20oC暗处培养5d，通过分别测定培养前后水样中溶解氧的含量，来计算出5d内的耗氧量，再根据稀释倍数求得其BOD5。
BOD5的测定是生物作用和化学作用的共同结果，必须严格按照操作规范进行，变更任何一个条件，都将影响测定结果的准确性和可比性。影响BOD5测定的条件包括pH值、温度、微生物种类和数量、无机盐含量、溶解氧和稀释倍数等。