1 引言
砷是一类广泛存在于土壤中的具有致癌作用的类金属元素，主要来源于含砷农药、化肥的施用及含砷污水灌溉等.据雷鸣等(2008)的调查，湖南郴州、衡阳等地稻田砷污染较严重，土壤砷含量最高达245 mg·kg-1，导致大米砷含量超标，造成严重的健康威胁和巨大的经济损失.同时，砷作为一种变价元素，不同价态毒性及生物有效性有较大差异，如三价砷生物毒性是五价砷的60~100倍.此外，水分可通过改变土壤氧化还原电位、铁锰氧化物等变价元素的价态而影响砷的生物有效性及其环境风险，如淹水导致As(Ⅴ)向As(Ⅲ)转化，提高了土壤中As(Ⅲ)的含量;同时，土壤水分会影响水稻籽粒中砷含量，灌浆期后湿润灌溉可显著降低糙米中砷含量.研究表明，稻田土壤水分含量可影响并改变土壤溶液及稻米中砷含量，而控制土壤水分含量是解决稻田土壤砷污染问题的有效途径之一，并揭示出水分是影响砷毒性的主要因素之一，尤其是在稻田土壤上.因此，需对二者作用关系进行系统探讨.
土壤酶是土壤的重要组成成分，土壤中所有生物化学过程的发生都得益于土壤酶的作用.酶促反应动力学是研究酶催化反应速度及各种因素(如污染物等)影响的方法，其结果不仅可显示土壤酶总量的高低，而且还可以反映酶与底物、重金属污染物等之间结合的紧密程度和作用过程，从而能深入探讨污染物与酶作用机理，故被认为是一种理想的研究手段.目前，国内外学者对砷的土壤酶效应进行了研究，发现有激活、抑制和无关3种作用，如As(Ⅴ)会抑制碱性磷酸酶及芳基硫酸酯酶活性，而As(Ⅲ)则不敏感;砷能激活土壤脲酶活性.对不同水分下土壤酶作用机理的研究也有零星报道，如Zhang等(2009a;2009b)发现，土壤脱氢酶活性及酶促最大反应速度均随水分含量升高而增加;高水分含量增强了磷酸酶与底物亲和力，提高了最大反应速度;淹水对土壤脲酶动力学参数无显著影响(隽英华等，2011).但目前对不同水分条件下砷与酶作用机理的研究则鲜见报道.因此，本文拟采用室内模拟培养试验的方法，从酶动力学角度研究水分对砷与土壤碱性磷酸酶关系的影响，揭示砷对碱性磷酸酶的作用受水分影响的机理，以期为稻田土壤砷污染的准确监测和保护修复提供依据.
2 材料与方法
2.1 供试土壤
供试土壤为采自江苏省中国科学院常熟农业生态试验站的水稻土(底潜铁聚水耕人为土，Endogleyic Fe-accumuli-Stagnic Anthrosols).采样时，先去除0~5 cm表层土，采用五点法取5~20 cm土样，混匀风干，过1 mm尼龙筛备用.常规方法测定土壤基本化学性质(鲍士旦，1997)，结果为有机质47.69 g·kg-1，pH=6.93(水土比2.5:1)，全氮3.1 g·kg-1，全磷0.61 g·kg-1，全钾18.02 g·kg-1，碱解氮10.66 mg·kg-1，速效磷11.74 mg·kg-1，速效钾112.90 mg·kg-1，阳离子交换量26.20 cmol·kg-1，游离氧化铁2.43 g·kg-1，总砷8.70 mg·kg-1，有效砷(0.5 mol·L-1 NaHCO3)0.32 mg·kg-1.
2.2 试验方案
向600 g土样中添加不同浓度的As(Ⅴ)(Na3AsO4·12H2O，AR)溶液，使As(Ⅴ)含量分别为0、25、50、100、200、400 mg·kg-1，并调节土壤含水量为最大持水量(WHC)的35%、65%、110%，分别代表土壤水分条件为干燥、湿润及淹水.混匀后加盖密闭，于(25±1)℃的培养箱中暗培养，期间称重法控制土壤水分含量;定期(1、8、15、30 d)取样测定并计算酶动力学参数.
土壤碱性磷酸酶动力学测定：在3.00 g土壤中加入0.25 mL甲苯，15 min后添加20 mL采用缓冲液(pH=9.4)配制的不同浓度(0.0010、0.0025、0.0050、0.010 mol·L-1)的磷酸苯二钠溶液，37 ℃培养，定时取样，采用磷酸苯二钠比色法测定土壤磷酸酶活性(关松荫，1987).每个处理重复3次，并设无底物和无土壤处理为对照.
2.3 数据处理
土壤酶动力学参数Km、Vmax的计算参考文献，具体而言，米氏常数Km和最大反应速度Vmax可用Michaelis方程的积分式计算：
经数学变换和整理得到：
式中，t为酶促反应时间(h)，S0、St分别是初始时刻和t时刻底物浓度(mmol·L-1).可见，上式是一条1/t×ln(S0/St)对1/t×(S0-St)的直线方程.在反应期间通过测定不同时间段利用的底物浓度(或生成的产物浓度)，并通过线性回归，即可求得Km和Vmax值.
土壤酶促反应速度常数k计算如下(和文祥等，2001)：
式中，t为酶促反应时间(h)，S0、St分别是初始时刻和t时刻底物浓度(mmol·L-1).
砷对土壤酶抑制常数Ki的计算见文献(朱铭莪，2011;谭向平，2014)，其中，竞争性抑制动力学方程为：
式中，Ki为抑制常数(mmol·L-1);Km*为抑制剂存在下表观米氏常数(mmol·L-1);C为外源砷剂量(mg·kg-1).
线性混合抑制动力学方程为：
式中，Vmax* 为抑制剂存在时酶表观最大速率(μg·g-1·h-1);KS*为酶-底物表观解离常数(mmol·L-1).对于线性混合型抑制，V*max=Vmax/β，Ks*=(α/β)Ks;其中：
式中，I为抑制剂浓度(mg·kg-1)，δKi为酶-底物-抑制剂解离常数(mmol·L-1)，δ可表示酶-抑制剂对底物的亲和力.
采用Microsoft Excel 2013和SPSS19.0软件对数据进行方差分析及模型拟合，LSD法对各处理间差异进行多重比较.
3 结果与分析
3.1 砷对碱性磷酸酶酶促反应动力学特征影响
3.1.1 米氏常数Km的变化
米氏常数Km表征酶与底物结合牢固程度，在数值上等于初速度达到最大反应速度1/2时的底物浓度.Km值越小，表明酶与底物结合越牢固，亲合力越大(和文祥等，1997).从表 1可以看出：①不同水分下碱性磷酸酶Km总体呈现35%WHC>65%WHC>110%WHC的变化规律，3个水分下Km均值分别为6.08、4.78、3.66 mmol·L-1，表明随水分含量增加，土壤碱性磷酸酶与底物的亲和力增强，酶与底物更易结合.②除个别处理外，其余处理土壤碱性磷酸酶Km随砷含量增加而显著增大，表明砷污染导致碱性磷酸酶与底物亲和力减弱.③不同处理下Km值虽有差异，但处于同一数量级，整个试验处理中Km变幅为2.34~10.95 mmol·L-1.④不同培养时间的Km变化较小，如砷含量为100 mg·kg-1时，35%WHC、65%WHC、110%WHC下Km变化范围分别为5.12~6.44、4.23~5.54、2.35~4.41 mmol·L-1，表明培养时间对土壤酶与底物亲和力影响较弱.⑤相关分析显示，35%WHC、65%WHC下砷含量与Km呈显著相关(r>0.913*)，而110%WHC下则相关性较差，表明干燥条件下砷显著降低土壤酶与底物的亲和力.
表 1 供试土壤碱性磷酸酶米氏常数
3.1.2 酶促反应最大反应速率Vmax的变化
最大反应速率(Vmax)可表征酶-底物复合物分解为酶和产物的能力及土壤中酶的总量，在数值上等于酶完全被底物饱和时的催化反应速度(和文祥等，2010).从表 2看出：①Vmax随水分含量增加显著降低，如第30 d，对照处理65%WHC、110%WHC的Vmax较35%WHC下分别降低了35.32%、40.94%，而当砷含量达200 mg·kg-1时，降幅分别达到42.66%、52.86%.②除个别处理外，随外源砷含量增加，35%WHC、65%WHC下Vmax间变化较小，最大变幅为26%，且处理间差异不显著，表明干燥和湿润条件下砷对土壤酶-底物复合物的解离影响较弱;110%WHC下Vmax则显著降低，揭示出淹水下砷污染阻碍了碱性磷酸酶-底物复合物解离.③110%WHC下，随砷含量增加Vmax降幅增大，可能是由于水分饱和条件下As(Ⅴ)向 As(Ⅲ)转化的缘故(曾希柏等，2010).④35%WHC、65%WHC下，Vmax随培养时间延长而增加，如砷含量为100 mg·kg-1时，两个水分下第30 d的Vmax值分别为第1 d的1.32、1.15倍，表明酶-底物复合物的分解速率加快，砷的毒性减弱.⑤利用Y=A/(1+B×C)模型(Speir et al.，1999)拟合Vmax与砷含量(C)的关系.结果(表 3)发现，仅110%WHC下二者呈显著负相关关系(r>0.912*)，表明淹水下Vmax可在一定程度上监测土壤砷的污染程度，且机理为完全抑制作用.⑥生态剂量值(Ecological Dose)ED10是指酶活性变化10%时外界污染物的浓度，可表征土壤轻度污染时的临界浓度(Doelman et al.，1989).计算获得水稻土砷污染ED10值为73.52~156.67 mg·kg-1.
表 2 供试土壤碱性磷酸酶最大反应速率Vmax
表 3 碱性磷酸酶最大反应速率Vmax与砷含量(C)的拟合关系
3.1.3 Vmax/Km及反应速度常数k的变化
在较大范围内，Vmax/Km是衡量酶促反应初速度的重要指标，可作为土壤质量的指标之一.反应速度常数k是酶总体催化能力的指标，从本质上反映酶促反应是“快”还是“慢”，且其值与底物浓度无关(和文祥等，2009).从表 4可知：①Vmax/Km、k随水分含量增加总体呈降低趋势，35%WHC下的Vmax/Km、k显著大于65%WHC、110%WHC下，表明较低水分含量有利于土壤酶催化反应的进行.②3种水分下，Vmax/Km、k均随砷含量的增加而显著降低，表明砷污染本质上降低了酶促反应初速度.③35%WHC、65%WHC下，Vmax/Km、k随培养时间延长而增加，这与Vmax变化规律一致.④利用模型Y=A/(1+B×C)拟合二者关系，结果(表 5)表明，Vmax/Km、k在一定程度上可作为土壤砷污染程度的监测指标，且砷对土壤碱性磷酸酶的作用机理为完全抑制(包括竞争性抑制和非竞争性抑制)作用(Speir et al.，1999).⑤计算获得Vmax/Km、k的ED10范围分别为20.45~70.87 mg·kg-1和66.00~131.89 mg·kg-1.⑥综合Vmax的结果可看出，Vmax/Km获得的ED10较小，且不同水分下均呈现出较好相关性，表明Vmax/Km对砷污染最为敏感，且其比Vmax可更全面、准确地表征不同水分下土壤砷污染程度.⑦根据剂量最小最敏感原则获得水稻土砷轻度污染的临界值为20.45 mg·kg-1，此值与国家土壤质量标准中的二级污染标准值(25 mg·kg-1)较为接近，从侧面表明动力学参数Vmax/Km可较好评价土壤砷污染程度.
表 4 供试土壤碱性磷酸酶动力学参数Vmax/Km及反应速度常数k
表 5 碱性磷酸酶动力学参数Vmax/Km、k与砷含量(C)的拟合关系
3.2 砷对碱性磷酸酶抑制动力学特征影响
抑制剂对土壤酶抑制类型一般包括竞争性、非竞争性、反竞争性及线性混合抑制等(朱铭莪，2011).由表 1、2可知，随砷含量增加，35%WHC、65%WHC下Vmax变化较小，Km则显著增大，显示此水分下砷酸根离子会与底物竞争碱性磷酸酶同一活性中心，抑制类型属于典型竞争性抑制;而110%WHC下，随砷含量增加，Vmax降低，Km总体增大，表明淹水时二者作用为线性混合抑制类型(包括竞争性抑制和非竞争性抑制)(朱铭莪，2011).
为进一步了解砷对磷酸酶的抑制特征，计算了不同条件下砷对土壤酶抑制常数Ki.Ki反映了抑制剂与酶形成复合物的亲和力，其值越小，说明抑制剂与土壤酶结合形成中间复合物的亲和力越强(和文祥等，2010).从表 6结果可以看出：①采用竞争性抑制模型(35%WHC、65%WHC)和线性混合抑制模型(110%WHC)拟合均达显著或极显著水平，揭示出不同水分含量下砷对碱性磷酸酶作用机理差异.②除第30 d外，其余处理110%WHC下Ki均小于35%WHC、65%WHC下，表明淹水增强了砷与土壤碱性磷酸酶的亲和力.③35%WHC下Ki随培养时间变化规律不明显，65%WHC、110%WHC下Ki在培养后期(30 d)显著大于前期(1~15 d)，表明随时间延长，砷与碱性磷酸酶的亲和力减弱，对酶的抑制作用减轻，这与Vmax、Vmax/Km、k等随时间变化所反映的规律一致.④比较Ki与Km可发现，除65%WHC、110%WHC下第30 d外，其余处理Ki与Km相差不大;培养第30 d，65%WHC、110%WHC下Ki明显大于Km，揭示出随时间延长，酶与底物亲和力强于酶与砷亲和力.⑤110%WHC下，线性混合抑制模型求得的δ>1，表明酶-抑制剂对底物的亲和力比酶对底物的亲和力低，进一步揭示出线性混合抑制中非竞争性抑制为主要抑制方式(朱铭莪，2011;谭向平，2014).
表 6 砷对供试土壤碱性磷酸酶抑制常数Ki影响
4 讨论
不同水分及砷污染处理下Km值虽有差异，但处于同一数量级，这与土壤碱性磷酸酶主要来源于土壤微生物有关(Frankenberger et al.，1983;Dick et al.，1984).不同水分下Km随砷含量增加而增大，表明砷污染减弱了碱性磷酸酶和底物的亲和力，这可能是因为砷酸根与磷酸根结构相似，二者共同竞争磷酸酶活性中心(朱铭莪，2011;王紫泉等，2013).35%WHC、65%WHC下Vmax随砷含量增大变化不明显，而110%WHC下则显著降低，表明110%WHC下，砷不仅通过与底物竞争碱性磷酸酶活性中心减缓了中间复合物的形成(Km增大)，也减弱了酶-底物复合物的解离能力(Vmax减小).这可能是因为水分饱和下，砷与酶活性或非活性中心结合，引起酶分子的构象改变，致使活性中心的催化作用降低(朱铭莪，2011);同时，在水分饱和与砷的双重胁迫下，土壤微生物活性受到抑制而使分泌的酶减少.
Km随水分含量增加显著降低，这可能是因为水分含量升高土壤更加分散，被土壤有机质或有机质-粘粒复合物吸附包裹的酶更多的解离暴露出来，增加了酶与底物的接触机会(隽英华等，2008).Marx等(2005)研究认为，营养物质(底物)在土壤异质体系中的扩散能力会影响土壤酶动力学参数.在土壤含水量较高情况下，水分可利用性好，底物的扩散能力较强，增加了酶与底物接触的机会，故Km减小(Zhang et al.，2009a).另外，供试土壤为水稻土，土壤中有机质、粘粒、铁锰氧化物等含量较大，水分含量较高情况下外源砷进入后砷酸根离子会迅速与土壤发生吸附、络合和沉淀反应等，可能会置换出部分原来被土壤粘粒吸附的碱性磷酸酶分子，使其从吸附态转变成游离态，从而使 Km 值变小(杨春璐等，2007).Vmax也随水分含量升高显著降低，这是由于水分含量增加，酶与底物亲和力增强(Km减小)，酶-底物复合物结合的更牢固，减弱了其分解为酶和产物的能力，从而降低形成产物的数量(朱铭莪，2011).另外，淹水条件下，土壤孔隙中氧气浓度降低，好氧微生物活性受到抑制，土壤酶分泌总量减少，也导致Vmax降低.具体参见污水宝商城资料或http://www.dowater.com更多相关技术文档。
随水分含量增加，土壤碱性磷酸酶动力学参数Km、Vmax、Vmax/Km、k均减小，土壤酶活性总体降低(谢伟等，2015)，表明土壤表观酶活性大小由动力学参数综合决定，反映在不同条件下，土壤酶的动力学参数发挥作用有所差异，并最终通过影响酶动力学参数间接改变不同水分下的土壤酶活性，揭示出不同水分条件下砷抑制碱性磷酸酶活性机理上的差异.如砷含量为400 mg·kg-1，培养第30 d时，尽管110%WHC下碱性磷酸酶Km最小(4.01 mmol·L-1)，Vmax/Km(44.60×10-3 h-1)也较大，但由于该水分下Vmax(160.33 μg·g-1·h-1)及k(13.00×10-3 h-1)均较小，导致碱性磷酸酶活性显著低于35%WHC、65%WHC下;而35%WHC下，虽然Km最大(9.65 mmol·L-1)，酶与底物亲和力最小，但因Vmax(400.26 μg·g-1·h-1)、Vmax/Km(57.97×10-3 h-1)、k(30.39×10-3 h-1)也最大，故该水分下碱性磷酸酶活性最高.可见，土壤酶动力学参数可从不同侧面、不同程度地反映土壤酶活性与酶促反应速度，在一定条件下，某一动力学因子起主导作用，从而决定表观酶活性的高低.
5 结论
1)随砷浓度增加，Km增大，Vmax(110%WHC)、Vmax/Km、k减小，表明砷污染不仅减弱了酶-底物的亲和力，且减弱了酶-底物复合物的分解能力，减弱了酶促反应初速度，从本质上抑制了酶促反应的进行.
2)Km、Vmax、Vmax/Km、k、Ki随水分含量增加而减小，表明水分含量升高虽增加了酶-底物亲和力，但也增强了砷与酶的亲和力，从本质上减弱了酶促反应速度，减缓了酶促反应的发生.
3)Y=A/(1+B×C)模型较好拟合了动力学参数Vmax/Km(Y)与土壤砷含量(C)之间的关系，表明Vmax/Km在一定程度上可表征不同水分下土壤砷污染程度，并以此计算获得水稻土砷轻度污染临界值为20.45 mg·kg-1，此值与国家土壤标准中的二级污染标准值较为接近.
4)水分条件影响砷对碱性磷酸酶抑制机理，干燥(35%WHC)及湿润(65%WHC)条件下为完全竞争性抑制作用;淹水(110%WHC)条件下为以完全非竞争性抑制为主的线性混合型抑制作用.各个酶动力学参数共同反映不同水分条件下砷对土壤碱性磷酸酶抑制机理上的差异.
