高效降解生活污水微生物筛选方法

　　申请日2015.12.07

　　公开(公告)日2016.02.24

　　IPC分类号C12Q1/04

　　摘要

　　一种高效降解生活污水的微生物筛选方法，包括以下步骤：将待筛选菌种添加到生活污水中处理7d;将处理后污水的上清夜经过滤、有机物富集与洗脱后分别联机进行GC/MS分析;分析得到的总离子流色谱图对比处理前后生活污水中有机物种类和含量的变化;以有机物种类的降低及含量的减少程度作为筛选高效降解生活污水优势菌株的指标。通过GC/MS分析测出菌株处理前后污水中组成成分的变化来筛选高效降解生活污水的优势菌株，得到的有关污水水质的相关信息比较全面，对于筛选优势菌株来说具有灵敏、快速，水质信息全面的优势，为污水处理领域菌株的筛选提供了一种可行的方法。

　　权利要求书

　　1.一种高效降解生活污水的微生物筛选方法，包括以下步骤：将待筛选菌种添加到生活污水中处理7d;将处理后污水的上清夜经过滤、有机物富集与洗脱后分别联机进行G C/MS分析;分析得到的总离子流色谱图对比处理前后生活污水中有机物种类和含量的变化;以有机物种类的降低及含量的减少程度作为筛选高效降解生活污水优势菌株的指标。

　　2.根据权利要求1所述的高效降解生活污水的微生物筛选方法，包括以下步骤：

　　(1)菌种活化：

　　将4℃斜面保存的酵母菌、细菌、乳酸菌活化，将其分别划线于相应固体培养基上，酵母菌于30℃培养2-3d，细菌于37℃培养1d，乳酸菌于37℃培养2-3d。

　　(2)种子液制备：

　　挑取活化的菌落，分别接种于各自液体培养基中，酵母菌于30℃、180rpm培养2d，细菌和乳酸菌于37℃、200rpm培养2d;

　　(3)将培养至对数期的各菌株的种子液分别接种到生活污水中，随后在摇床上以20℃、110 rpm的条件进行为期7天的净化处理;

　　(4)对用菌体处理后的污水分别进行GC/MS分析，以对生活污水中的有机物进行定性定量分析，得出经各菌株降解后对应污水的总离子流色谱图;

　　(5)对相同体积的未处理的污水原样进行GC/MS分析，对比污水经菌株处理前后的总离子流色谱图，分析对比有机物种类和含量;

　　(6)以有机物种类和含量减少程度作为菌株筛选指标，经处理后有机物种类和含量降低较多的污水，其所对应的菌种即为所得。

　　3.根据权利要求2所述的高效降解生活污水的微生物筛选方法，其特征在于：所述各种子培养基分别为：

　　酵母菌培养基为YEPD培养基，其中各组分浓度为蛋白胨2g/L、酵母膏1g/L、葡萄糖2 g/L，PH6.0，121℃灭菌20min;

　　细菌培养基为肉汤培养基，其中各组分浓度为蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、NaCl 5g/L，PH7.2-7.4，121℃灭菌20min;

　　乳酸菌培养基为MRS培养基，其中各组分浓度为蛋白胨10g/L、牛肉粉5g/L、酵母粉4 g/L、葡萄糖20g/L、K2HPO42g/L、无水乙酸钠5g/L、柠檬酸二铵2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、土温801.0ml，PH 6.2-6.4，121℃灭菌15min。

　　4.根据权利要求3所述的高效降解生活污水的微生物筛选方法，其特征在于：用Biosc reen 全自动生长曲线测定仪对实验室所保藏的多株酵母菌、细菌、乳酸菌进行生长曲线的测定，确定菌体生长到对数期的时间，以确定菌株接种到污水中的最佳时期。

　　5.根据权利要求4所述的高效降解生活污水的微生物筛选方法，其特征在于：对污水进行GC/MS分析的步骤如下：

　　制备吸附柱：取一规格为1cm×25cm的玻璃柱，把经过纯化处理的XAD- 2树脂装入玻璃柱，使树脂床的高度为13cm，保持装柱均匀，柱内无气泡;

　　菌株降解后污水的富集与洗脱：将经过菌株处理后的对应污水静置沉淀后分别取上清液经G4砂芯漏斗过滤，以25ml/min的流速流经吸附柱，取富集树脂置于分液漏斗中用80ml 二氯甲烷萃取6次，合并所得二氯甲烷萃取剂并通过上层为无水硫酸钠、下层为玻璃棉的 30ml漏斗，将所得液体放于通风橱内经自然浓缩至2.0～3.0ml，密封，低温冷藏待测;

　　GC/MS分析的气相色谱条件：

　　气体温度：240℃，

　　柱温：在30℃下保持2min，然后以15℃/min的速率升温至150℃，再以15℃/min的速率升温至240℃，保持10min，

　　进样口温度:240℃，

　　载气:高纯He(99.999%),流量:1.1ml/min;

　　GC/MS分析的质谱条件：

　　电离方式:电子轰击源，

　　电子轰击温度:140℃，

　　电离能量：70eV，

　　扫描范围：29～400m/z;

　　待仪器运行稳定之后，取浓缩液1ul进样分析，得出经过菌株分别降解后各污水的总离子流色谱图。

　　说明书

　　高效降解生活污水的微生物筛选方法

　　技术领域

　　本发明涉及生活污水处理的技术领域，具体说是一种高效降解生活污水的微生物筛选方法。

　　背景技术

　　我国面临着水量型缺水和水质型缺水的双重考验，人均水资源占有量低于世界平均水平，居民用水量逐渐加大，对于水环境质量的关注和要求日渐提高。大量未处理生活污水的直接排放对于我国水环境的质量造成了安全隐患如引起附近水体的富营养化等。生活污水主要来源于洗涤、厨房、冲厕，特征污染物为COD、TN、TP、SS、氨氮，其中有机污染物含量高，污水可生化性强，重金属及有毒有害物质含量较低。

　　生物处理技术是利用微生物的代谢作用将有机污染物分解为CO2和H2O，或者有机酸和醇等，从而达到净化污水的目的。与物理化学方法相比，生物处理法费用低廉，同时用于污水处理的微生物繁殖快，容易培养，适应不同种类废水环境的能力强。在生物处理技术领域通常对高效降解生活污水中特征污染物的菌株进行筛选，以实现对污水的生物降解处理。

　　目前，用于高效降解生活污水的菌株筛选方法主要是通过检测菌株的相关酶活性，如降解生活污水中脂肪、蛋白质、纤维素等大分子物质的相应酶活性，然而，生活污水中含有的有机物种类较多，仅仅检测污水中特定的几种有机物降解酶活性并不能反应菌株降解污水中有机物的总体效果，并且测定酶活时的影响因素较多如温度、PH等，且每次测定结果的稳定性较差。

　　发明内容

　　本发明要解决的技术问题是提供一种高效降解生活污水的微生物筛选方法。

　　本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是:

　　本发明的高效降解生活污水的微生物筛选方法，包括以下步骤：将待筛选菌种添加到生活污水中处理7d;将处理后污水的上清夜经过滤、有机物富集与洗脱后分别联机进行GC/MS分析;分析得到的总离子流色谱图对比处理前后生活污水中有机物种类和含量的变化;以有机物种类的降低及含量的减少程度作为筛选高效降解生活污水优势菌株的指标。

　　本发明还可以采用以下技术措施：

　　本发明具体包括以下步骤：

　　(1)菌种活化：

　　将4℃斜面保存的酵母菌、细菌、乳酸菌活化，将其分别划线于相应固体培养基上，酵母菌于30℃培养2-3d，细菌于37℃培养1d，乳酸菌于37℃培养2-3d。

　　(2)种子液制备：

　　挑取活化的菌落，分别接种于各自液体培养基中，酵母菌于30℃、180rpm培养2d，细菌和乳酸菌于37℃、200rpm培养2d;

　　(3)将培养至对数期的各菌株的种子液分别接种到生活污水中，随后在摇床上以20℃、110rpm的条件进行为期7天的净化处理;

　　(4)对用菌体处理后的污水分别进行GC/MS分析，以对生活污水中的有机物进行定性定量分析，得出经各菌株降解后对应污水的总离子流色谱图;

　　(5)对相同体积的未处理的污水原样进行GC/MS分析，对比污水经菌株处理前后的总离子流色谱图，分析对比有机物种类和含量;

　　(6)以有机物种类和含量减少程度作为菌株筛选指标，经处理后有机物种类和含量降低较多的污水，其所对应的菌种即为所得。

　　所述各种子培养基分别为：

　　酵母菌培养基为YEPD培养基，其中各组分浓度为蛋白胨2g/L、酵母膏1g/L、葡萄糖2g/L，PH6.0，121℃灭菌20min;

　　细菌培养基为肉汤培养基，其中各组分浓度为蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、NaCl5g/L，PH7.2-7.4，121℃灭菌20min;

　　乳酸菌培养基为MRS培养基，其中各组分浓度为蛋白胨10g/L、牛肉粉5g/L、酵母粉4g/L、葡萄糖20g/L、K2HPO42g/L、无水乙酸钠5g/L、柠檬酸二铵2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、土温801.0ml，PH6.2-6.4，121℃灭菌15min。

　　用Bioscreen全自动生长曲线测定仪对实验室所保藏的多株酵母菌、细菌、乳酸菌进行生长曲线的测定，确定菌体生长到对数期的时间，以确定菌株接种到污水中的最佳时期。

　　对污水进行GC/MS分析的步骤如下：

　　制备吸附柱：取一规格为1cm×25cm的玻璃柱，把经过纯化处理的XAD-2树脂装入玻璃柱，使树脂床的高度为13cm，保持装柱均匀，柱内无气泡;

　　菌株降解后污水的富集与洗脱：将经过菌株处理后的对应污水静置沉淀后分别取上清液经G4砂芯漏斗过滤，以25ml/min的流速流经吸附柱，取富集树脂置于分液漏斗中用80ml二氯甲烷萃取6次，合并所得二氯甲烷萃取剂并通过上层为无水硫酸钠、下层为玻璃棉的30ml漏斗，将所得液体放于通风橱内经自然浓缩至2.0～3.0ml，密封，低温冷藏待测;