申请日2015.09.08
公开(公告)日2015.11.18
IPC分类号C12N1/36; C12N1/20; C12R1/01; C12R1/06; C12R1/07; C12R1/38
摘要
一种煤制油废水COD降解用菌种驯化试剂盒及驯化方法，试剂盒包括富集管、驯化预制管A、驯化预制管B;驯化方法包括缺氧驯化和好氧驯化。该试剂盒是通过本实验室在全国大量采集煤制油废水样品，对废水成分进行分析，并通过实验配制出了一种可以模拟真实污水的驯化培养基，并以此为基础形成了试剂盒。该驯化培养基具有较强的适应性，经本试剂盒驯化后的菌种投放到多个煤制油废水中，COD降解能力均有所提高，大大缩短污水处理启动时间，该试剂盒可模拟缺氧、好氧生物法工艺，可应用于煤制油污水处理菌剂的产品优化，以及污水厂在运行前对污泥进行快速驯化。
摘要附图
权利要求书
1.一种煤制油废水COD降解用菌种驯化试剂盒，其特征在于：它是由富集 管、驯化预制管A、驯化预制管B组成;其中：
(一)、富集管：
富集管的制备：
(1)、取牛肉膏0.7-1.0g，蛋白胨0.7-1.0g，磷酸二氢钾1.2-2.0g，磷 酸氢二钠1.5-2.5g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5%的碳酸钠和5%HCl调 pH至7.00-7.50，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基20ml;分装完毕 后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭 菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础富集管制备完成;
(2)、取苯酚10-13mg，萘酚2-4mg，喹啉1-2mg，甲醇0.08-0.12ml，丁醇 0.08-0.12ml，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜 过滤除菌;过滤除菌完成后，取2ml经过过滤除菌的溶液，0.2-0.3μl煤制柴 油，在无菌条件下加入到步骤(1)中的基础富集管中，在高速漩涡震荡器上震 荡5-10min，至此富集管制备完成;
(二)、驯化预制管A：
驯化预制管A的制备：
(1)、取牛肉膏0.4-0.7g，蛋白胨0.4-0.7g，丙三醇0.4-0.6ml，磷酸二 氢钾1.2-2.0g，磷酸氢二钠1.5-2.5g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5%的 碳酸钠和5%HCl调pH至7.50-8.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养 基30ml;分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并 冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管A制备完成;
(2)、取苯酚18-22mg，萘酚8-12mg，喹啉4-6mg，苯胺4-6mg，吡啶0.4-0.6mg， 辛基十二烷醇0.1-0.2mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物A;
(3)、取萘130-170mg，甲苯3-7mg，邻苯二甲酸二丁酯2-3mg，苯并咪唑 2-3mg，甲醇0.08-0.12ml，丁醇0.08-0.12ml，用100ml75%乙醇溶解，此溶液 为醇添加物A;
(4)、分别取水添加物A3ml，醇添加物A0.012ml，煤制柴油1.0-1.2μl， 在无菌条件下装到步骤(1)中的基础驯化预制管A中，在高速漩涡震荡器上震 荡5-10min，至此驯化预制管A制备完成;
(三)、驯化预制管B：
驯化预制管B的制备：
(1)、取牛肉膏0.2-0.4g，蛋白胨0.2-0.4g，丙三醇0.6-0.8ml，磷酸二 氢钾1.2-2.0g，磷酸氢二钠1.5-2.5g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5%的 碳酸钠和5%HCl调pH至7.50-8.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养 基30ml;分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并 冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管B制备完成;
(2)、取苯酚150-170mg，萘酚18-22mg，喹啉9-12mg，苯胺10-12mg，吡 啶0.9-1.2mg，辛基十二烷醇0.4-0.6mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌 条件下用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物B;
(3)、取萘540-560mg，甲苯18-22mg，邻苯二甲酸二丁酯8-12mg，苯并咪 唑8-12mg，甲醇1.8-2.2ml，丁醇1.8-2.2ml，用100ml75%乙醇溶解，此溶液 为醇添加物B;
(4)、分别取水添加物B3ml，醇添加物B0.012ml，煤制柴油3.0-4.0μl， 在无菌条件下装到步骤(1)中的基础驯化预制管B中，在高速漩涡震荡器上震 荡5-10min，至此驯化预制管B制备完成。
2.一种采用权利要求1所述的煤制油废水COD降解用菌种驯化试剂盒驯化 方法，其特征在于：包括以下步骤：
(一)、缺氧阶段驯化：
步骤1、将待驯化样品取1-3ml接种到第1富集管中，将第1富集管的管盖 拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时;
步骤2、取经第1富集管培养的样品5ml，接种到第1驯化预制管A中，将 第1富集管连同管内剩余样品放入4℃冷藏;
步骤3、将第1驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm 震荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，取上清液A130ml放入100ml 经过灭菌的第1三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第2驯化预 制管A中继续培养;
步骤4、将第2驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm 震荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，取上清液A230ml放入100ml 经过灭菌的第2三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第3驯化预 制管A中继续培养;
步骤5、将第3驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm 震荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，取上清液A330ml放入100ml 经过灭菌的第3三角瓶中，然后放入4℃留存;当样品经过步骤4的第3驯化 预制管A培养后，取沉淀5ml，接种到第1驯化预制管B中;
步骤6、将步骤5的第1驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、 100-150rpm震荡培养48-72h;培养完成后静置30-60min，取上清液B130ml放 入100ml经过灭菌的第4三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第2 驯化预制管B中继续培养;
步骤7、将步骤6的第2驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、 100-150rpm震荡培养48-72h;培养完成后静置30-60min，取上清液B230ml放 入100ml经过灭菌的第5三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第3 驯化预制管B中继续培养;
步骤8、将步骤7的第3驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、 100-150rpm震荡培养48-72h;培养完成后静置30-60min，取上清液B330ml放 入100ml经过灭菌的第6三角瓶中，然后放入4℃留存;当样品经过步骤7的 第3驯化预制管B培养后，取沉淀1ml，接种到第2富集管中，将第2富集管的 管盖拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时;培养后将第 2富集管冷藏或冷冻保存，此驯化后菌种为缺氧驯化菌种;
(二)、好氧阶段驯化：
步骤9、当样品经过步骤5的第3驯化预制管A培养完成后，将冷藏的第1 富集管取出并恢复室温;待恢复室温6-10h后，取5ml接种到上清液A3中;
步骤10、将步骤9接种后的上清液A3放入摇床25-28℃、150-200rpm震荡 培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接 种到上清液A2中继续培养;
步骤11、将步骤10接种后的上清液A2放入摇床25-28℃、150-200rpm震 荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml 接种到上清液A1中继续培养;
步骤12、将步骤11接种后的上清液A1放入摇床25-28℃、150-200rpm震 荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，当样品经过 上清液A1驯化培养后，取沉淀5ml，接种到上清液B3中;
步骤13、将步骤12接种后的上清液B3入摇床25-28℃、150-200rpm震荡 培养48-72小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接 种到上清液B2中继续培养;
步骤14、将步骤13接种后的上清液B2入摇床25-28℃、150-200rpm震荡 培养48-72小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接 种到上清液B1中继续培养;
步骤15、将步骤14接种后的上清液B1入摇床25-28℃、150-200rpm震荡 培养48-72小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，当样品经过步 骤上清液B1驯化培养后，取沉淀1ml，接种到第3富集管中，将第3富集管的 管盖拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时;培养后将第 3富集管冷藏或冷冻保存，此驯化后菌种为好氧驯化菌种。
说明书
煤制油废水COD降解用菌种驯化试剂盒及驯化方法
技术领域：
本发明属于一种菌种驯化试剂盒及驯化方法，特别涉及一种用于降解煤制油 废水COD用菌种的驯化试剂盒及驯化方法。
背景技术：
煤制油是以煤炭为原料，通过化学加工过程生产油品和石油化工产品的一项 技术，包含煤直接液化和煤间接液化两种技术路线。我国煤贮量占世界总贮量的 36%，占我国能源总量的70%以上，因此在我国，煤制油是燃料化工的主导。
煤制油生产过程中产生的含油废水的特点是：多环芳烃和苯系物及其衍生 物、酚、硫等有毒物质浓度高，可生化性差，是一种比较难处理的废水。综合废 水中COD根据污水处理工艺不同一般在1000-5000mg/L左右。含油废水的危害 主要表现在：油类物质形成的薄膜漂浮在水面上，空气中的氧就不能溶解于水中， 水中的溶解氧就会减少，致使水体中浮游生物等因缺氧而死亡，水生植物的光合 作用也受到限制，从而水体的自净作用将会受到影响，水质也会变臭，水资源的 利用价值也会遭到破坏，而且油中一些低沸点芳香烃化合物的存在会导致人类癌 症的发生，从而影响人体健康。
目前国内处理煤制油废水的主要工艺路线基本遵行“预处理+生化处理+ 深度处理”，其中生化处理是污水处理工艺的重要阶段。通过对国内多个煤制油 企业的实地走访，目前对于预处理后的煤制油废水，一般采用缺氧、好氧生物法 处理(A/O工艺)。微生物是废水生物处理过程的核心，制约着污水处理的效果。 在污水厂启动初期或运行受到冲击需要重新恢复运行时，国内普遍采用的方法是 向污水处理设施中投加污泥和营养物质，或者投加市场上现有的专用微生物菌 剂，达到污水处理设施正常运行的目的。对于煤制油废水的处理，投加污泥和菌 剂的效果受到以下几方面问题的制约：一、煤制油废水中含有多种对微生物有毒 害作用的物质，投加到污水中的污泥或菌种中的部分微生物容易被废水中的毒性 物质所抑制，为解决此问题往往需要对污泥或菌种在投加前进行长时间的驯化; 二、煤制油废水中有大量油类等难降解有机物，这些物质很难被微生物利用并降 解，解决这个问题通常需要工艺的合理设计与污泥或菌剂的驯化共同解决;三、 与普通污水相比，煤制油废水处理设施的启动时间更长，需要更长时间的驯化。
发明内容：
本发明的目的在于解决以上问题，提供一种菌种驯化试剂盒及驯化方法，经 本试剂盒驯化后的菌种投放到煤制油废水中，可以大大缩短污水处理启动时间， 提高COD降解效率。该驯化培养基具有较广的适用性，通过其驯化后的菌种投入 到多个煤制油污水样品后，其COD降解能力均有所提高。该试剂盒可以模拟缺氧、 好氧生物法工艺，可以应用于煤制油污水处理菌剂的产品优化，以及污水厂在运 行前对污泥进行快速驯化。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种煤制油废水COD降解用菌种 驯化试剂盒，其特征在于：它是由富集管、驯化预制管A、驯化预制管B组成; 其中：
(一)、富集管：
富集管的制备：
(1)、取牛肉膏0.7-1.0g，蛋白胨0.7-1.0g，磷酸二氢钾1.2-2.0g，磷 酸氢二钠1.5-2.5g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5%的碳酸钠和5%HCl调 pH至7.00-7.50，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基20ml;分装完毕 后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭 菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础富集管制备完成;
(2)、取苯酚10-13mg，萘酚2-4mg，喹啉1-2mg，甲醇0.08-0.12ml，丁醇 0.08-0.12ml，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜 过滤除菌;过滤除菌完成后，取2ml经过过滤除菌的溶液，0.2-0.3μl煤制柴 油，在无菌条件下加入到步骤(1)中的基础富集管中，在高速漩涡震荡器上震 荡5-10min，至此富集管制备完成;
(二)、驯化预制管A：
驯化预制管A的制备：
(1)、取牛肉膏0.4-0.7g，蛋白胨0.4-0.7g，丙三醇0.4-0.6ml，磷酸二 氢钾1.2-2.0g，磷酸氢二钠1.5-2.5g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5%的 碳酸钠和5%HCl调pH至7.50-8.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养 基30ml;分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并 冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管A制备完成;
(2)、取苯酚18-22mg，萘酚8-12mg，喹啉4-6mg，苯胺4-6mg，吡啶0.4-0.6mg， 辛基十二烷醇0.1-0.2mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物A;
(3)、取萘130-170mg，甲苯3-7mg，邻苯二甲酸二丁酯2-3mg，苯并咪唑 2-3mg，甲醇0.08-0.12ml，丁醇0.08-0.12ml，用100ml75%乙醇溶解，此溶液 为醇添加物A;
(4)、分别取水添加物A3ml，醇添加物A0.012ml，煤制柴油1.0-1.2μl， 在无菌条件下装到步骤(1)中的基础驯化预制管A中，在高速漩涡震荡器上震 荡5-10min，至此驯化预制管A制备完成;
(三)、驯化预制管B：
驯化预制管B的制备：
(1)、取牛肉膏0.2-0.4g，蛋白胨0.2-0.4g，丙三醇0.6-0.8ml，磷酸二 氢钾1.2-2.0g，磷酸氢二钠1.5-2.5g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5%的 碳酸钠和5%HCl调pH至7.50-8.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养 基30ml;分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并 冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管B制备完成;
(2)、取苯酚150-170mg，萘酚18-22mg，喹啉9-12mg，苯胺10-12mg，吡 啶0.9-1.2mg，辛基十二烷醇0.4-0.6mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌 条件下用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物B;
(3)、取萘540-560mg，甲苯18-22mg，邻苯二甲酸二丁酯8-12mg，苯并咪 唑8-12mg，甲醇1.8-2.2ml，丁醇1.8-2.2ml，用100ml75%乙醇溶解，此溶液 为醇添加物B;
(4)、分别取水添加物B3ml，醇添加物B0.012ml，煤制柴油3.0-4.0μl， 在无菌条件下装到步骤(1)中的基础驯化预制管B中，在高速漩涡震荡器上震 荡5-10min，至此驯化预制管B制备完成。
一种采用煤制油废水COD降解用菌种驯化试剂盒驯化方法，其特征在于：包 括以下步骤：
(一)、缺氧阶段驯化：
步骤1、将待驯化样品取1-3ml接种到第1富集管中，将第1富集管的管盖 拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时;
步骤2、取经第1富集管培养的样品5ml，接种到第1驯化预制管A中，将 第1富集管连同管内剩余样品放入4℃冷藏;
步骤3、将第1驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm 震荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，取上清液A130ml放入100ml 经过灭菌的第1三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第2驯化预 制管A中继续培养;
步骤4、将第2驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm 震荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，取上清液A230ml放入100ml 经过灭菌的第2三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第3驯化预 制管A中继续培养;
步骤5、将第3驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm 震荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，取上清液A330ml放入100ml 经过灭菌的第3三角瓶中，然后放入4℃留存;当样品经过步骤4的第3驯化 预制管A培养后，取沉淀5ml，接种到第1驯化预制管B中;
步骤6、将步骤5的第1驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、 100-150rpm震荡培养48-72h;培养完成后静置30-60min，取上清液B130ml放 入100ml经过灭菌的第4三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第2 驯化预制管B中继续培养;
步骤7、将步骤6的第2驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、 100-150rpm震荡培养48-72h;培养完成后静置30-60min，取上清液B230ml放 入100ml经过灭菌的第5三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第3 驯化预制管B中继续培养;
步骤8、将步骤7的第3驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、 100-150rpm震荡培养48-72h;培养完成后静置30-60min，取上清液B330ml放 入100ml经过灭菌的第6三角瓶中，然后放入4℃留存;当样品经过步骤7的 第3驯化预制管B培养后，取沉淀1ml，接种到第2富集管中，将第2富集管的 管盖拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时;培养后将第 2富集管冷藏或冷冻保存，此驯化后菌种为缺氧驯化菌种;
(二)、好氧阶段驯化：
步骤9、当样品经过步骤5的第3驯化预制管A培养完成后，将冷藏的第1 富集管取出并恢复室温;待恢复室温6-10h后，取5ml接种到上清液A3中;
步骤10、将步骤9接种后的上清液A3放入摇床25-28℃、150-200rpm震荡 培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接 种到上清液A2中继续培养;
步骤11、将步骤10接种后的上清液A2放入摇床25-28℃、150-200rpm震 荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml 接种到上清液A1中继续培养;
步骤12、将步骤11接种后的上清液A1放入摇床25-28℃、150-200rpm震 荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，当样品经过 上清液A1驯化培养后，取沉淀5ml，接种到上清液B3中;
步骤13、将步骤12接种后的上清液B3入摇床25-28℃、150-200rpm震荡 培养48-72小时;培养完成后静置-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接 种到上清液B2中继续培养;
步骤14、将步骤13接种后的上清液B2入摇床25-28℃、150-200rpm震荡 培养48-72小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接 种到上清液B1中继续培养;
步骤15、将步骤14接种后的上清液B1入摇床25-28℃、150-200rpm震荡 培养48-72小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，当样品经过步 骤上清液B1驯化培养后，取沉淀1ml，接种到第3富集管中，将第3富集管的 管盖拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时;培养后将第 3富集管冷藏或冷冻保存，此驯化后菌种为好氧驯化菌种。
本发明的优点和有益效果是：
该试剂盒是通过本实验室在全国大量采集煤制油废水样品，对废水成分进行 分析，并通过实验配制出了一种具有广泛适用性的可以模拟真实污水的煤制油废 水菌种驯化培养基，并以此为基础形成了试剂盒，经过其驯化的菌种，可以作为 高效煤制油废水COD处理菌剂或污泥，提高菌种在废水中的适应能力，缩短污水 处理启动时间。
