申请日2015.07.18
公开(公告)日2015.11.18
IPC分类号C12N1/20; C02F3/34; C12R1/05; C02F101/34; C12R1/40; C02F101/38; C12R1/01
摘要
一种用于废水中生物降解的二元复合菌群构建方法，其特点是，包括苯酚和苯胺两种构建方法，均含有：选择菌株、菌株活化、菌株驯化、菌株保存、菌落形态观察、菌悬液制备、不同菌株初始配比的混合菌悬液的制备和二元复合菌群最佳配比选择，在两株具有不同菌落特征，对同一种有机污染物具有降解能力的菌株的基础上，将菌体以不同比例接种于含有目标有机污染物的废水中，在指定的反应条件下，经过指定的生化反应时间后，测定不同接种比例下菌株对目标污染物的降解情况，同时对反应终点时刻培养液中两种菌的菌落形成单位进行计量，最终通过污染物降解效率及两株菌的相对菌落形成单位的计算结果确定用于目标污染物生物降解的二元复合菌群的配比。
权利要求书
1.一种用于废水中苯酚生物降解的二元复合菌群的构建方法，其特征在于，它包括以下 内容：
1)选择菌株：选择粪产碱菌和乙酸钙不动杆菌，粪产碱菌和乙酸钙不动杆菌均来源于中 国普通微生物菌种保藏管理中心，粪产碱菌的菌株编号为CGMCCNo.1.2098，乙酸钙不动杆 菌的菌株编号为CGMCCNo.1.6186，将粪产碱菌的菌株简称为PR1、乙酸钙不动杆菌的菌株 简称为PR2;
2)菌株的活化：从营养肉汁琼脂斜面上挑取PR1和PR2的菌苔分别接种于100mL牛肉 膏蛋白胨液体培养基中，置于30℃，150rpm摇床中振荡培养24h进行菌株的活化;
3)菌株的驯化：取活化后的PR1和PR2培养液各10mL，分别接种于含有苯酚的驯化培 养基中，置于30℃，150rpm摇床中振荡培养，进行菌株的驯化，培养24h后再重复上述过程 进行第二个周期的驯化，共驯化5个周期，120h，前两个驯化周期加入1.5mL经过滤除菌的 10%(w/v)苯酚溶液，第三个周期加入3.0mL经过滤除菌的10%(w/v)苯酚溶液，最后两个驯化 周期加入8mL经过滤除菌的10%(w/v)苯酚溶液;
4)菌株的保存：将驯化后的菌株采用倍比稀释法在平板上得到单菌落后，挑取单菌落接 种到斜面培养基上，待菌苔长出后放入4℃冰箱中低温保存备用;
5)菌落形态观察：采用平板划线的方法将菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中， 置于30℃生化培养箱中培养24h后，观察其菌落形态，主要通过菌落的颜色、透明度、表面 光滑性和边缘形态对用于苯酚生物降解的二元复合菌群构建的PR1和PR2菌株进行区分;
6)菌悬液制备：将驯化后的PR1和PR2分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于 30℃，150rpm摇床中振荡培养24h，将培养液置于台式高速冷冻离心机中以10000rpm离心 5min后，弃去上清液后用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液重悬，再次离心后弃 去上清液，如此操作两次清洗菌体，再用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液重悬， 分别制成OD600=1.2的菌悬液置于冰箱中冷藏备用，同时通过平板计数法分别测定菌悬液中 PR1和PR2的活菌数;
7)不同PR1、PR2初始配比的混合菌悬液的制备：根据菌悬液中测定的PR1和PR2活 菌数，吸取PR1和PR2的菌悬液，使混合后的PR1、PR2菌悬液的总活菌量为2×108CFU/mL， 并使PR1和PR2活菌初始比例分别为0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和 10/0，其中10/0代表体系中仅有PR1，0/10代表体系中仅有PR2;
8)二元复合菌群最佳配比的选择：将PR1和PR2活菌初始比例为0/10、1/9、2/8、3/7、 4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌悬液以10%(v/v)的量分别接种于含有200mg/L 苯酚的无机盐培养液中，于30℃，150rpm摇床中振荡培养12h后测定残留的苯酚和TOC浓 度，同时通过倍比稀释法依据菌落形态特征对生物降解反应结束后体系中PR1和PR2的数量 进行计量;定义CFUPR1为PR1在10/0体系中的活菌数，即仅接种PR1的体系，CFUPR2为 PR2在0/10体系中的活菌数，即仅接种PR2的体系，CFUPR1·PR2为PR1在PR2存在时的活菌 数，CFUPR2·PR1为PR2在PR1存在时的活菌数，PR1的相对活菌数PR2的相对活菌数当RCFU<1时，代表一株菌生长和繁殖受到了另 一株菌的抑制，而当RCFU>1时，代表另一株菌的存在对该菌株的生长和繁殖起到了促进作 用;根据两株菌在不同初始活菌比例下的苯酚降解率、TOC降解率以及RCFU计算结果，选 择苯酚降解率、TOC降解率最高且RCFUPR1和RCFUPR2计算结果均大于1的初始活菌比例作 为苯酚生物降解二元复合菌群的构建比例，此时二元复合菌群对苯酚的降解效果最佳且形成 了互利共生的关系。
2.根据权利1所述的用于废水中苯酚生物降解的二元复合菌群的构建方法，其特征在于： 所述的牛肉膏蛋白胨培养基的组分为牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min后备用，制作牛肉膏蛋白胨固体培养基时加入20g琼脂。
3.根据权利1所述的用于废水中苯酚生物降解的二元复合菌群的构建方法，其特征在于： 所述的驯化培养基的组分为(NH4)2SO43g，KH2PO40.5g，NaHPO40.5g，MgSO4·7H2O0.3g， 微量元素液1mL，蒸馏水1000mL，pH7.5，121℃灭菌20min，待冷却后加入经过滤除菌的 10%(w/v)苯酚溶液。
4.根据权利1所述的用于废水中苯酚生物降解的二元复合菌群的构建方法，其特征在于： 所述的微量元素液的组分为FeSO4·7H2O0.5g，MnSO4·H2O0.15g，ZnSO40.14g，CoCl20.2g， 蒸馏水1000mL。
5.根据权利1所述的用于废水中苯酚生物降解的二元复合菌群的构建方法，其特征在于： 所述的苯酚降解率及TOC降解率采用以下公式进行计算：
6.一种用于废水中苯胺生物降解的二元复合菌群的构建方法，其特征在于：它包括以下 内容：
1)选择菌株：选择恶臭假单胞菌和乙酸钙不动杆菌，恶臭假单胞菌和乙酸钙不动杆菌均 来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，粪产碱菌的菌株编号为CGMCCNo.1.1003，乙酸 钙不动杆菌的菌株编号为CGMCCNo.1.3615，将恶臭假单胞菌的菌株简称为BA1、乙酸钙 不动杆菌的菌株简称为BA2;
2)菌株的活化：从营养肉汁琼脂斜面上挑取BA1和BA2的菌苔分别接种于100mL牛 肉膏蛋白胨液体培养基中，置于30℃，150rpm摇床中振荡培养24h进行菌株的活化;
3)菌株的驯化：取活化后的BA1和BA2培养液各10mL，分别接种于含有苯胺的驯化 培养基中，置于30℃，150rpm摇床中振荡培养，进行菌株的驯化，培养36h后再重复上述过 程进行第二个周期的驯化，共驯化5个周期，180h，前两个驯化周期加入1.5mL经过滤除菌 的10%(w/v)苯胺溶液，第三个周期加入3.0mL经过滤除菌的10%(w/v)苯胺溶液，最后两个驯 化周期加入8mL经过滤除菌的10%(w/v)苯胺溶液;
4)菌株的保存：将驯化后的菌株采用倍比稀释法在平板上得到单菌落后，挑取单菌落接 种到斜面培养基上，待菌苔长出后放入4℃冰箱中低温保存备用;
5)菌落形态观察：采用平板划线的方法将菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中， 置于30℃生化培养箱中培养24h后，观察其菌落形态，主要通过菌落的颜色、透明度、表面 光滑性和边缘形态对用于苯胺生物降解的二元复合菌群构建的BA1和BA2菌株进行区分;
6)菌悬液制备：将驯化后的BA1和BA2分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于 30℃，150rpm摇床中振荡培养24h，将培养液置于台式高速冷冻离心机中以10000rpm离心 5min后，弃去上清液后用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液重悬，再次离心后弃 去上清液，如此操作两次清洗菌体，再用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液重悬， 分别制成OD600=1.2的菌悬液置于冰箱中冷藏备用，同时通过平板计数法分别测定菌悬液中 BA1和BA2的活菌数;
7)不同BA1、BA2初始配比的混合菌悬液的制备：根据菌悬液中测定的BA1和BA2 活菌数，吸取BA1和BA2的菌悬液，使混合后的BA1、BA2菌悬液的总活菌量为 2×108CFU/mL，并使BA1和BA2活菌初始比例分别为0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、 7/3、8/2、9/1和10/0，其中10/0代表体系中仅有BA1，0/10代表体系中仅有BA2;
8)二元复合菌群最佳配比的选择：将BA1和BA2活菌初始比例为0/10、1/9、2/8、3/7、 4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌悬液分别以10%(v/v)的量分别接种于含苯胺300mg/L 的无机盐培养液中，于30℃，150rpm摇床中振荡培养36h后测定残留的苯胺和TOC浓度， 同时通过倍比稀释法依据菌落形态特征对生物降解反应结束后体系中BA1和BA2的数量进 行计量;定义CFUBA1为BA1在10/0体系中的活菌数，即仅接种BA1的体系，CFUBA2为BA2 在0/10体系中的活菌数，即仅接种BA2的体系，CFUBA1·BA2为BA1在BA2存在时的活菌数， CFUBA2·BA1为BA2在BA1存在时的活菌数，BA1的相对活菌数PR2 的相对活菌数当RCFU<1时，代表一株菌生长和繁殖受到了另一株 菌的抑制，而当RCFU>1时，代表另一株菌的存在对该菌株的生长和繁殖起到了促进作用; 根据两株菌在不同初始活菌比例下的苯胺降解率、TOC降解率以及RCFU计算结果，选择苯 胺降解率、TOC降解率最高且RCFUBA1和RCFUBA2计算结果均大于1的初始活菌比例作为 苯胺生物降解二元复合菌群的构建比例，此时二元复合菌群对苯胺的降解效果最佳且形成了 互利共生的关系。
7.根据权利要求6所述的用于废水中苯胺生物降解的二元复合菌群的构建方法，其特征 在于：所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的组分为牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水 1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min后备用，制作牛肉膏蛋白胨固体培养基时加入20g琼脂。
8.根据权利要求6所述的用于废水中苯胺生物降解的二元复合菌群的构建方法，其特征 在于：所述的驯化液体培养基的组分为(NH4)2SO43g，KH2PO40.5g，NaHPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，微量元素液1mL，蒸馏水1000mL，pH7.5，121℃灭菌20min，待冷却后加入经过滤 除菌的10%(w/v)苯胺溶液。
9.根据权利要求6所述的用于废水中苯胺生物降解的二元复合菌群的构建方法，其特征 在于：所述的微量元素液的组分为FeSO4·7H2O0.5g，MnSO4·H2O0.15g，ZnSO40.14g，CoCl20.2g，蒸馏水1000mL。
10.根据权利要求6所述的用于废水中苯胺生物降解的二元复合菌群的构建方法，其特征 在于：所述的苯胺降解率及TOC降解率采用以下公式进行计算：
说明书
一种用于废水中生物降解的二元复合菌群构建方法
技术领域
本发明属于废水生物处理领域，是一种用于废水中生物降解的二元复合菌群构建方法。
背景技术
近年来，随着化学工业的飞速发展，新技术和新材料的开发与应用使得废水中含有大量 的有机污染物。由于这些物质本身结构的复杂性和生物陌生性，污染环境中能降解转化该类 污染物的土著微生物种类和数量较少，甚至没有能降解某些特殊污染物的土著微生物，因此， 传统的废水生化处理工艺很难将其有效的去除，这些难降解有机污染物将随废水处理系统外 排水或生物固体废弃物以第二污染源的形式最终反馈到水体、土壤及大气中，对人类及其他 生命体的健康和生态环境都将构成严重威胁。此外，城市化进程使得城市用地逐年紧张，传 统污水处理工艺流程长、占地面积大、操作复杂等矛盾也日趋突出，提标和提效改造成为城 市污水处理厂在现有基础上节能降耗和更好发挥其污染治理效果的必经途径。
大量研究表明，通过向生化处理系统中投加复合菌群的生物增强技术可以最大限度发挥 微生物的潜力，有效解决传统生化处理工艺难降解有机污染物去除效率低、运行效果不稳定 等突出问题。复合菌群又称复合菌剂、复合微生物、混合菌剂等，是基于微生态学理论，利 用微生物菌群的联合作用，由两种或两种上的微生物共同培养、相互作用、相互影响，最终 达到发挥其最大群体优势的微生态系统。在污染环境中，单一菌株往往不能完成或只能对有 机物的降解起很微弱的作用，而复合菌群可以利用多种微生物的共生互利关系，通过多步转 化将复杂的有机物协同代谢为对环境无害的终产物。复合菌群的出现是人类对于微生物认识 的自然结果，很多生化反应过程是单一微生物不能完成或只能微弱进行的，而在两种或多种 微生物共存的条件下，微生物之间的共生、共养和共荣等使得生化反应过程朝着出现有益效 果的方向发展。随着纯培养技术的完善和对微生物间互生和共生现象的研究，人为的微生物 混合培养或混合发酵日益备受重视，由此产生了结构和功能多样的复合菌群。
复合菌群的构建原理是将不同的微生物菌株针对不同的处理体系进行科学组合，构建出 高效的或具有特定功能的菌群。其构建过程首先是对微生物进行优选、驯化，将具有不同功 能的菌群提取出来，然后针对各类工业废水、天然水体和市政污水等不同处理对象、环境， 经多次组合搭配，构建出最优组合的复合菌群。处理对象和应用场合的不同使目前复合菌群 的开发呈多样化的发展趋势。目前，我国环境科学领域对复合菌群的研究主要集中于两大类： 一类是对现有以日本比嘉照夫教授研制的有效微生物菌群(HighEffectiveComplex Microorganisms，简称EM)为代表的商品化复合菌剂进行研究和应用，另一类是根据所应用的 环境条件和所达的目的，利用筛选到的微生物配置、优化的微生物制剂。商品化的复合菌群 细菌种类和配比固定，难以适应生产实践中含有多种污染物的废水处理的需要;此外，利用 筛选到的菌株进行复合菌群的构建时往往要经过较长周期的驯化和反复的配比实验以获得菌 株复合的最佳比例，且实验室条件下确定的最佳比例投加到实际污染场地后能否长期维持稳 定的群落结构并形成良好的互利共生关系很难预知。因此，开发简单、快速和有效的复合菌 群构建方法是将其更好地规模化应用到废水中所含有机污染物的生物分解和转化过程中亟待 解决的问题。
发明内容
本发明的目的是，为强化微生物对废水中苯酚和苯胺的分解和转化，而提供科学合理， 便于实施，配比明确，降解效果好，群落结构稳定，用于废水中苯酚生物降解的二元复合菌 群的构建方法和用于废水中苯胺生物降解的二元复合菌群构建方法。
本发明的目的之一是由以下技术方案来实现的：一种用于废水中苯酚生物降解的二元复 合菌群构建方法，其特征在于，它包括以下内容：
1)选择菌株：选择粪产碱菌和乙酸钙不动杆菌，粪产碱菌和乙酸钙不动杆菌均来源于中 国普通微生物菌种保藏管理中心，粪产碱菌的菌株编号为CGMCCNo.1.2098，乙酸钙不动杆 菌的菌株编号为CGMCCNo.1.6186，将粪产碱菌的菌株简称为PR1、乙酸钙不动杆菌的菌株 简称为PR2;
2)菌株的活化：从营养肉汁琼脂斜面上挑取PR1和PR2的菌苔分别接种于100mL牛肉 膏蛋白胨液体培养基中，置于30℃，150rpm摇床中振荡培养24h进行菌株的活化;
3)菌株的驯化：取活化后的PR1和PR2培养液各10mL，分别接种于含有苯酚的驯化培 养基中，置于30℃，150rpm摇床中振荡培养，进行菌株的驯化，培养24h后再重复上述过程 进行第二个周期的驯化，共驯化5个周期，120h，前两个驯化周期加入1.5mL经过滤除菌的 10%(w/v)苯酚溶液，第三个周期加入3.0mL经过滤除菌的10%(w/v)苯酚溶液，最后两个驯化 周期加入8mL经过滤除菌的10%(w/v)苯酚溶液;
4)菌株的保存：将驯化后的菌株采用倍比稀释法在平板上得到单菌落后，挑取单菌落接 种到斜面培养基上，待菌苔长出后放入4℃冰箱中低温保存备用;
5)菌落形态观察：采用平板划线的方法将菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中， 置于30℃生化培养箱中培养24h后，观察其菌落形态，主要通过菌落的颜色、透明度、表面 光滑性和边缘形态对用于苯酚生物降解的二元复合菌群构建的PR1和PR2菌株进行区分;
6)菌悬液制备：将驯化后的PR1和PR2分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于 30℃，150rpm摇床中振荡培养24h，将培养液置于台式高速冷冻离心机中以10000rpm离心 5min后，弃去上清液后用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液重悬，再次离心后弃 去上清液，如此操作两次清洗菌体，再用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液重悬， 分别制成OD600=1.2的菌悬液置于冰箱中冷藏备用，同时通过平板计数法分别测定菌悬液中 PR1和PR2的活菌数;
7)不同PR1、PR2初始配比的混合菌悬液的制备：根据菌悬液中测定的PR1和PR2活 菌数，吸取PR1和PR2的菌悬液，使混合后的PR1、PR2菌悬液的总活菌量为2×108CFU/mL， 并使PR1和PR2活菌初始比例分别为0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和 10/0，其中10/0代表体系中仅有PR1，0/10代表体系中仅有PR2;
8)二元复合菌群最佳配比的选择：将PR1和PR2活菌初始比例为0/10、1/9、2/8、3/7、 4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌悬液以10%(v/v)的量分别接种于含有200mg/L 苯酚的无机盐培养液中，于30℃，150rpm摇床中振荡培养12h后测定残留的苯酚和TOC浓 度，同时通过倍比稀释法依据菌落形态特征对生物降解反应结束后体系中PR1和PR2的数量 进行计量;定义CFUPR1为PR1在10/0体系中的活菌数，即仅接种PR1的体系，CFUPR2为 PR2在0/10体系中的活菌数，即仅接种PR2的体系，CFUPR1·PR2为PR1在PR2存在时的活菌 数，CFUPR2·PR1为PR2在PR1存在时的活菌数，PR1的相对活菌数PR2的相对活菌数当RCFU<1时，代表一株菌生长和繁殖受到了另 一株菌的抑制，而当RCFU>1时，代表另一株菌的存在对该菌株的生长和繁殖起到了促进作 用;根据两株菌在不同初始活菌比例下的苯酚降解率、TOC降解率以及RCFU计算结果，选 择苯酚降解率、TOC降解率最高且RCFUPR1和RCFUPR2计算结果均大于1的初始活菌比例作 为苯酚生物降解二元复合菌群的构建比例，此时二元复合菌群对苯酚的降解效果最佳且形成 了互利共生的关系。
所述的牛肉膏蛋白胨培养基的组分为牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000mL， pH7.0，121℃灭菌20min后备用，制作牛肉膏蛋白胨固体培养基时加入20g琼脂。
所述的驯化培养基的组分为(NH4)2SO43g，KH2PO40.5g，NaHPO40.5g，MgSO4·7H2O0.3g， 微量元素液1mL，蒸馏水1000mL，pH7.5，121℃灭菌20min，待冷却后加入经过滤除菌的 10%(w/v)苯酚溶液。
所述的微量元素液的组分为FeSO4·7H2O0.5g，MnSO4·H2O0.15g，ZnSO40.14g，CoCl20.2g，蒸馏水1000mL。
所述的苯酚降解率及TOC降解率采用以下公式进行计算：
(1)
(2)
本发明的目的之二是，一种用于废水中苯胺生物降解的二元复合菌群构建方法，其特征 在于：它包括以下内容：
1)选择菌株：选择恶臭假单胞菌和乙酸钙不动杆菌，恶臭假单胞菌和乙酸钙不动杆菌均 来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，粪产碱菌的菌株编号为CGMCCNo.1.1003，乙酸 钙不动杆菌的菌株编号为CGMCCNo.1.3615，将恶臭假单胞菌的菌株简称为BA1、乙酸钙 不动杆菌的菌株简称为BA2;
2)菌株的活化：从营养肉汁琼脂斜面上挑取BA1和BA2的菌苔分别接种于100mL牛 肉膏蛋白胨液体培养基中，置于30℃，150rpm摇床中振荡培养24h进行菌株的活化;
3)菌株的驯化：取活化后的BA1和BA2培养液各10mL，分别接种于含有苯胺的驯化 培养基中，置于30℃，150rpm摇床中振荡培养，进行菌株的驯化，培养36h后再重复上述过 程进行第二个周期的驯化，共驯化5个周期，180h，前两个驯化周期加入1.5mL经过滤除菌 的10%(w/v)苯胺溶液，第三个周期加入3.0mL经过滤除菌的10%(w/v)苯胺溶液，最后两个驯 化周期加入8mL经过滤除菌的10%(w/v)苯胺溶液;
4)菌株的保存：将驯化后的菌株采用倍比稀释法在平板上得到单菌落后，挑取单菌落接 种到斜面培养基上，待菌苔长出后放入4℃冰箱中低温保存备用;
5)菌落形态观察：采用平板划线的方法将菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中， 置于30℃生化培养箱中培养24h后，观察其菌落形态，主要通过菌落的颜色、透明度、表面 光滑性和边缘形态对用于苯胺生物降解的二元复合菌群构建的BA1和BA2菌株进行区分;
6)菌悬液制备：将驯化后的BA1和BA2分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于 30℃，150rpm摇床中振荡培养24h，将培养液置于台式高速冷冻离心机中以10000rpm离心 5min后，弃去上清液后用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液重悬，再次离心后弃 去上清液，如此操作两次清洗菌体，再用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液重悬， 分别制成OD600=1.2的菌悬液置于冰箱中冷藏备用，同时通过平板计数法分别测定菌悬液中 BA1和BA2的活菌数;
7)不同BA1、BA2初始配比的混合菌悬液的制备：根据菌悬液中测定的BA1和BA2 活菌数，吸取BA1和BA2的菌悬液，使混合后的BA1、BA2菌悬液的总活菌量为 2×108CFU/mL，并使BA1和BA2活菌初始比例分别为0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、 7/3、8/2、9/1和10/0，其中10/0代表体系中仅有BA1，0/10代表体系中仅有BA2;
8)二元复合菌群最佳配比的选择：将BA1和BA2活菌初始比例为0/10、1/9、2/8、3/7、 4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌悬液分别以10%(v/v)的量分别接种于含苯胺300mg/L 的无机盐培养液中，于30℃，150rpm摇床中振荡培养36h后测定残留的苯胺和TOC浓度， 同时通过倍比稀释法依据菌落形态特征对生物降解反应结束后体系中BA1和BA2的数量进 行计量;定义CFUBA1为BA1在10/0体系中的活菌数，即仅接种BA1的体系，CFUBA2为BA2 在0/10体系中的活菌数，即仅接种BA2的体系，CFUBA1·BA2为BA1在BA2存在时的活菌数， CFUBA2·BA1为BA2在BA1存在时的活菌数，BA1的相对活菌数PR2 的相对活菌数当RCFU<1时，代表一株菌生长和繁殖受到了另一株 菌的抑制，而当RCFU>1时，代表另一株菌的存在对该菌株的生长和繁殖起到了促进作用; 根据两株菌在不同初始活菌比例下的苯胺降解率、TOC降解率以及RCFU计算结果，选择苯 胺降解率、TOC降解率最高且RCFUBA1和RCFUBA2计算结果均大于1的初始活菌比例作为 苯胺生物降解二元复合菌群的构建比例，此时二元复合菌群对苯胺的降解效果最佳且形成了 互利共生的关系。
所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的组分为牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水 1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min后备用，制作牛肉膏蛋白胨固体培养基时加入20g琼脂。
所述的驯化液体培养基的组分为(NH4)2SO43g，KH2PO40.5g，NaHPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，微量元素液1mL，蒸馏水1000mL，pH7.5，121℃灭菌20min，待冷却后加入经过滤 除菌的10%(w/v)苯胺溶液。
所述的微量元素液的组分为FeSO4·7H2O0.5g，MnSO4·H2O0.15g，ZnSO40.14g，Cocl20.2g，蒸馏水1000mL。
所述的苯胺降解率及TOC降解率采用以下公式进行计算：
(1)
(2)
将本发明与现有技术相比，结果如下：
中国专利申请号201110287122.X，名称为一种用于降解城市废水的优势菌群及其制备方 法，公开了制备构成优势菌群的阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、戈登氏菌(Gordonia)和恶 臭假单胞菌(Pseudomonasputida)体积百分比分别是20～24%、54～58%和26～18%，然而并未明 确指出获得该体积百分的具体方法。而本发明通过测定不同比例的两株菌投加到待处理废水 中后对目标污染物的浓度及活菌数量，综合考察污染物处理效果和微生物群落结构的稳定性， 从而获得二元复合菌群的精确配比;
中国专利申请号200710064363.1，名称为一种降解酚类有机物的方法及其专用菌群，公 开了一种采用含有发孢甲基弯曲菌的混合菌群MY9CGMCCNo.1893在温和条件下高效降 解酚类有机物的方法，然而并未给出混合菌群的具体群落结构组成及所涉及微生物的相对比 例，而本发明是在获得具体菌株并了解其污染物降解特性的基础上，通过简便而快速的构建 方法，综合二元复合菌群的污染物降解效果和群落结构稳定性，给出菌株的确切配比;
中国专利申请号200810063737.2，名称为降解“三苯”VOCs废气的复合微生物菌剂的制备 方法，公开了的用于“三苯”VOCs废气降解的复合微生物菌剂是以含目标污染物的培养基驯化 活性污泥的方法获得的，驯化周期长，且该发明并未对经干燥后碾磨成粉末状的复合微生物 菌剂发酵物经长期保存后的污染物效果进行验证，由于群落结构未知，该复合菌群的规模化 生产及应用效果难以得到保证，而本发明是在分离纯化高效降解菌株的基础上，采用复合菌 群的构建方法，对复合菌群的配比进行优化，其稳定的群落结构组成能够保证其高效稳定的 污染物降解效果，且在实际生产应用中，其种子液的发酵过程可分别进行，以获得活性高的 初始菌株，为复合菌群的构建奠定了必要的基础;
中国专利申请号201110128285.3，名称为一种降解多环芳烃的混合菌剂，公开了混合菌 剂的具体组成，然而并未涉及混合菌剂中不同微生物在种子液中的相对比例和投加到待处理 废水中后其相对数量的变化规律，由于不同污染场地中污染物的浓度及环境条件存在着不同 程度的差异，因而该混合菌剂的针对性和实用性有待考证，而本发明直接以含有目标难降解 有机污染物的待处理废水为环境介质，通过污染物降解效果及群落结构稳定性的考察，能获 得针对性强、污染物降解效果好和群落结构稳定的二元复合菌群，因而能保证良好的实地应 用效果;
中国专利申请号2013105523877，名称为一种用于降解造纸废水的复合菌群及其制备方 法，公开了构成降解造纸废水复合菌群的土壤杆菌、杆状菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌和 施氏假单胞菌的体积百分比分别为5-8%、2-5%、10-15%、26-41%和34-56%，但是并未给出 获得该体积比的依据，同时由于各菌株培养营养条件不同，其对数增长期培养液中各菌株的 相对数量也有所不同，以体积比作为定量化依据降低了该复合菌群在实际生产中的可操作性。 而本发明中涉及了两种独立的高效菌株，在实际操作中，可以采用测定残余目标污染物浓度 和RCFU的方法，对降解效果和菌株在待处理污染中的存在状态进行系统的把握，从而能构 建出配比明确、降解效果好和群落结构稳定的二元复合菌群;
本发明的用于废水中苯酚生物降解的二元复合菌群构建方法和用于废水中苯胺生物降解 的二元复合菌群的构建方法均具有科学合理，便于实施，配比明确，降解效果好，群落结构 稳定等优点。
