申请日2014.04.15
公开(公告)日2014.07.09
IPC分类号G01N33/18
摘要
本发明公开了运用秀丽隐杆线虫对污水处理厂尾水进行毒性分析的方法，该方法包括以下步骤：(1)秀丽隐杆线虫的培养;(2)大肠杆菌OP50的培养;(3)秀丽隐杆线虫的复苏;(4)秀丽隐杆线虫的传代;(5)秀丽隐杆线虫的同步化;(6)使用秀丽隐杆线虫对待测尾水样品的综合毒性进行测试。本发明的有益效果：运用模式生物——秀丽隐杆线虫对污水处理厂尾水进行毒性分析，通过对比空白对照组的线虫与暴露线虫的致死率、生殖率、运动行为和世代周期之间的差异，从而判断废水的综合毒性的大小。
摘要附图
权利要求书
1.运用秀丽隐杆线虫对污水处理厂尾水进行毒性分析的方法，其特
征在于包括以下步骤：
(1)秀丽隐杆线虫的培养;
(2)大肠杆菌OP50的培养;
(3)秀丽隐杆线虫的复苏;
(4)秀丽隐杆线虫的传代;
(5)秀丽隐杆线虫的同步化;
(6)使用秀丽隐杆线虫对待测尾水样品的综合毒性进行测试。
2.根据权利要求1所述的运用秀丽隐杆线虫对污水处理厂尾水进行毒性分析的方法，其特征在于：
(1)秀丽隐杆线虫的培养：使用线虫培养基NGM培养秀丽隐杆线虫，以大肠杆菌OP50为食物，在15-25℃环境下培养;
(2)大肠杆菌OP50的培养：使用LB液体培养基培养，温度控制在15-25℃;
(3)秀丽隐杆线虫的复苏：取1-4只1.5ml的离心管并分别加入0.5-1.5ml的OP50溶液，将离心管放入离心机中，设置r为11000-13000rpm，离心0.5-1.5min，然后取出离心管，用微量移液器吸出750μl上清溶液，弃去，剩余的浓缩的OP50用移液器混匀后转移到NGM培养皿的中央，轻轻转动培养皿使OP50均匀的摊在培养皿中，待菌苔风干后，取手术刀，蘸上75%乙醇，再在酒精灯上灼烧灭菌，冷却后，用手术刀割取培养基放入新的含有OP50的NGM培养基中，然后将含有需要复苏的秀丽隐杆线虫的培养基放入生化培养箱中，设定温度为15-25℃，进行培养;
(4)秀丽隐杆线虫的传代：取已铺有E.coli OP50的NGM培养基，然后将手术刀片放在酒精灯上灼烧灭菌，待冷却后，割取含有秀丽隐杆线虫的培养基放入新的含有E.coli OP50的培养基中，将新的培养基放入15-25℃生化培养箱中培养;
(5)秀丽隐杆线虫的同步化：准备孕虫生长板2-4块，用无菌水冲洗孕虫生长板，吸取2.5-4.5ml的秀丽隐杆线虫洗脱液于50ml离心管中，取0.5ml的5M NaOH溶液与1ml漂白液混合配置裂解液，将新鲜配置的裂解液倒入50ml的离心管中，在室温下每1-3min振荡一次，每次1-3s以将成虫虫体腐蚀，取3-5个1.5ml离心管，将裂解液均匀加入其中，设置离心机的r为2000-4000rpm，离心0.5-1.5min，去上清，然后向离心管中加入0.5-1.5mL的无菌水，轻微振荡，再设置离心机的r为2000-4000rpm，离心0.5-1.5min，弃上清时留0.08-0.12mL的溶液，并混匀，将虫卵加到新的铺有E.coli OP50的NGM培养基中并不加在E.coli OP50上，在超净工作台中晾干，将加有虫卵的培养皿放到15-25℃的生化培养箱中，36-60h后虫卵发育成成虫，可进行试验;
(6)使用秀丽隐杆线虫对待测尾水样品的综合毒性进行测试：取样4-8个典型污水处理厂的尾水样品，将同步化36-60h的秀丽隐杆线虫置于待测样品中暴露12h-48h，通过对秀丽隐杆线虫的存活率、生殖率、运动行为和世代周期的对比，对待测样品进行毒性分析。
3.根据权利要求1或2所述的运用秀丽隐杆线虫对污水处理厂尾水进行毒性分析的方法，其特征在于：步骤(1)中秀丽隐杆线虫的培养包括少量传代和大量传代，所述少量传代为用直径为1mm的铂金丝挑取处于产卵期的雌雄同体的秀丽隐杆线虫于铺有OP50的NGM培养基中，不能破坏琼脂层，在15-25℃的恒温培养箱中培养;大量传代为用经灼烧灭菌后的手术刀片切一块含有秀丽隐杆线虫的培养基，转移到铺有OP50的NGM培养基上，秀丽隐杆线虫即从食物少的琼脂边缘爬向E.coli OP50菌苔上生长，在15-25℃的恒温培养箱中培养。
4.根据权利要求1或2所述的运用秀丽隐杆线虫对污水处理厂尾水进行毒性分析的方法，其特征在于，步骤(6)中对秀丽隐杆线虫的存活率的研究方法是取样4-8个典型污水处理厂的尾水样品，将同步化36-60h后的秀丽隐杆线虫暴露于尾水样品中，12-48h后统计线虫致死率，具体方法为：吸取尾水样品160-200μl于96孔板中，每种水样做三个平行样，再取含同步化36-60h后的秀丽隐杆线虫的培养皿，用无菌水冲洗培养皿，将秀丽隐杆线虫洗脱液转移至无菌的50ml离心管中，加无菌水稀释至秀丽隐杆线虫液密度为800-1200条/ml，再将离心管中秀丽隐杆线虫液摇匀，用微量移液器吸取15-25μl液体分别加入到96孔板中的尾水样品中，在显微镜下观察，每个孔中15-25条线虫，最后用封口膜将96孔板封好，放入15-25℃生化培养箱中培养，12-48h后取出统计一次存活率。
5.根据权利要求1或2所述的运用秀丽隐杆线虫对污水处理厂尾水进行毒性分析的方法，其特征在于，步骤(6)中对秀丽隐杆线虫的生殖率的研究方法是取样4-8个典型污水处理厂的尾水样品，将同步化36-60h后的秀丽隐杆线虫暴露于尾水样品中，12-48h后统计秀丽隐杆线虫的生殖率，具体方法为：取灭过菌的干净1.5ml离心管4-8个，每管中分别加入0.5-1.5ml尾水样品，再取含同步化36-60h秀丽隐杆线虫的培养皿，用无菌水冲洗培养皿，将秀丽隐杆线虫洗脱液转移至无菌的50ml离心管中，静置一段时间待秀丽隐杆线虫沉淀后，弃上清至管中剩余2ml液体，将管中秀丽隐杆线虫摇匀，吸取15-25μl液体分别加入到尾水样品中，放入15-25℃的生化培养箱中培养，12-48h后将离心管取出，挑出一条秀丽隐杆线虫放入含新鲜OP50的培养基上培养，使其产卵，每12-36h转移一次准备孕虫生长板，至秀丽隐杆线虫停止产卵，每种样品做4-6个平行样，待虫卵孵化成成虫后，统计板中秀丽隐杆线虫总数。
6.根据权利要求1或2所述的运用秀丽隐杆线虫对污水处理厂尾水进行毒性分析的方法，其特征在于，步骤(6)中对秀丽隐杆线虫的运动行为的的研究方法是取样4-8个典型污水处理厂的尾水样品，将同步化36-60h后的秀丽隐杆线虫暴露于尾水样品中，12-48h后统计暴露的秀丽隐杆线虫1min内头部摆动次数及20s内身体弯曲次数，具体方法为：取灭过菌的干净1.5ml离心管4-8个，每管中分别加入0.5-1.5ml尾水样品，取含同步化36-60h秀丽隐杆线虫的培养皿，用无菌水冲洗培养皿，将秀丽隐杆线虫洗脱液转移至无菌的50ml离心管中，静置待秀丽隐杆线虫沉淀后，弃上清至管中剩余2ml液体，将管中秀丽隐杆线虫摇匀，吸取15-25μl液体分别加入到尾水样品中，放入15-25℃生化培养箱中培养，12-48h后将离心管取出，挑出一条秀丽隐杆线虫放入干净不含食物的NGM培养基上，恢复1min后计算20s内线虫的身体弯曲次数，每种尾水样品做3-6个平行样，再取干净不含食物的NGM板中滴一滴无菌水，挑出一条秀丽隐杆线虫放入水中，恢复1min后统计lmin内头部摆动次数，每种尾水样品做3-6个平行样。
7.根据权利要求1或2所述的运用秀丽隐杆线虫对污水处理厂尾水进行毒性分析的方法，其特征在于，步骤(6)中对秀丽隐杆线虫的世代周期的的研究方法是取样4-8个典型污水处理厂的尾水样品，将同步化36-60h后的秀丽隐杆线虫暴露于尾水样品中，12-48h后统计暴露的秀丽隐杆线虫的世代周期时间，具体方法为：取灭过菌的干净1.5ml离心管4-8个，每管中分别加入0.5-1.5ml尾水样品，取含同步化36-60h秀丽隐杆线虫的培养皿，用无菌水冲洗培养皿，将秀丽隐杆线虫洗脱液转移至无菌的50ml离心管中，静置待秀丽隐杆线虫沉淀后，弃上清至管中剩余2ml液体，将管中秀丽隐杆线虫摇匀，吸取15-25μl液体分别加入到尾水样品中，放入15-25℃生化培养箱中培养，12-48h后将秀丽隐杆线虫取出，挑出一条秀丽隐杆线虫放入含有食物的NGM培养基上，等待线虫产卵，当第一枚卵产出后，记下时间并挑出秀丽隐杆线虫，将虫卵放入生化培养箱培养，培养1-3天后，虫卵孵化生长为成虫，每隔1h观察一次，记录它产下第一个卵的时间，从而算出暴露秀丽隐杆线虫的世代周期时间，每种离子浓度处理3-6条秀丽隐杆线虫。
说明书
运用秀丽隐杆线虫对污水处理厂尾水进行毒性分析的方法
技术领域
本发明涉及污水毒性检测领域，尤其涉及运用秀丽隐杆线虫对污水处理厂尾水进行毒性分析的方法。
背景技术
随着工业的发展及城镇化水平的提高，污水的排放量不断增加。目前，大部分城市污水和工业废水都进入污水处理厂集中治理，污水处理厂将污水收集统一处理，处理后的尾水除了一少部分回用外，大部分尾水排入了自然界的水体中。因此污水处理厂排放的尾水对受纳水体环境将是很大的挑战。
发明内容
本发明提供运用秀丽隐杆线虫对污水处理厂尾水进行毒性分析的方法。
本发明采用的技术方案：运用秀丽隐杆线虫对污水处理厂尾水进行毒性分析的方法，该方法包括以下步骤：
(1)秀丽隐杆线虫的培养：使用线虫培养基NGM培养秀丽隐杆线虫，以大肠杆菌OP50为食物，在15-25℃环境下培养;
(2)大肠杆菌OP50的培养：使用LB液体培养基培养，温度控制在15-25℃;
(3)秀丽隐杆线虫的复苏：取1-4只1.5ml的离心管并分别加入0.5-1.5ml的OP50溶液，将离心管放入离心机中，设置r为11000-13000rpm，离心0.5-1.5min，然后取出离心管，用微量移液器吸出750μl上清溶液，弃去，剩余的浓缩的OP50用移液器混匀后转移到NGM培养皿的中央，轻轻转动培养皿使OP50均匀的摊在培养皿中，待菌苔风干后，取手术刀，蘸上75%乙醇，再在酒精灯上灼烧灭菌，冷却后，用手术刀割取培养基放入新的含有OP50的NGM培养基中，然后将含有需要复苏的秀丽隐杆线虫的培养基放入生化培养箱中，设定温度为15-25℃，进行培养;
(4)秀丽隐杆线虫的传代：取已铺有E.coli OP50的NGM培养基，然后将手术刀片放在酒精灯上灼烧灭菌，待冷却后，割取含有秀丽隐杆线虫的培养基放入新的含有E.coli OP50的培养基中，将新的培养基放入15-25℃生化培养箱中培养;
(5)秀丽隐杆线虫的同步化：准备孕虫生长板2-4块，用无菌水冲洗孕虫生长板，吸取2.5-4.5ml的秀丽隐杆线虫洗脱液于50ml离心管中，取0.5ml的5M NaOH溶液与1ml漂白液混合配置裂解液，将新鲜配置的裂解液倒入50ml的离心管中，在室温下每1-3min振荡一次，每次1-3s以将成虫虫体腐蚀，取3-5个1.5ml离心管，将裂解液均匀加入其中，设置离心机的r为2000-4000rpm，离心0.5-1.5min，去上清，然后向离心管中加入0.5-1.5mL的无菌水，轻微振荡，再设置离心机的r为2000-4000rpm，离心0.5-1.5min，弃上清时留0.08-0.12mL的溶液，并混匀，将虫卵加到新的铺有E.coli OP50的NGM培养基中并不加在E.coli OP50上，在超净工作台中晾干，将加有虫卵的培养皿放到15-25℃的生化培养箱中，36-60h后虫卵发育成成虫，可进行试验;
(6)使用秀丽隐杆线虫对待测尾水样品的综合毒性进行测试：取样4-8个典型污水处理厂的尾水样品，将同步化36-60h的秀丽隐杆线虫置于待测样品中暴露12h-48h，通过对秀丽隐杆线虫的存活率、生殖率、运动行为和世代周期的对比，对待测样品进行毒性分析。
步骤(1)中秀丽隐杆线虫的培养包括少量传代和大量传代，所述少量传代为用直径为1mm的铂金丝挑取处于产卵期的雌雄同体的秀丽隐杆线虫于铺有OP50的NGM培养基中，不能破坏琼脂层，在15-25℃的恒温培养箱中培养;大量传代为用经灼烧灭菌后的手术刀片切一块含有秀丽隐杆线虫的培养基，转移到铺有OP50的NGM培养基上，秀丽隐杆线虫即从食物少的琼脂边缘爬向E.coli OP50菌苔上生长，在15-25℃的恒温培养箱中培养。
步骤(6)中对秀丽隐杆线虫的存活率的研究方法是取样4-8个典型污水处理厂的尾水样品，将同步化36-60h后的秀丽隐杆线虫暴露于尾水样品中，12-48h后统计线虫致死率，具体方法为：吸取尾水样品160-200μl于96孔板中，每种水样做三个平行样，再取含同步化36-60h后的秀丽隐杆线虫的培养皿，用无菌水冲洗培养皿，将秀丽隐杆线虫洗脱液转移至无菌的50ml离心管中，加无菌水稀释至秀丽隐杆线虫液密度为800-1200条/ml，再将离心管中秀丽隐杆线虫液摇匀，用微量移液器吸取15-25μl液体分别加入到96孔板中的尾水样品中，在显微镜下观察，每个孔中15-25条线虫，最后用封口膜将96孔板封好，放入15-25℃生化培养箱中培养，12-48h后取出统计一次存活率。
步骤(6)中对秀丽隐杆线虫的生殖率的研究方法是取样4-8个典型污水处理厂的尾水样品，将同步化36-60h后的秀丽隐杆线虫暴露于尾水样品中，12-48h后统计秀丽隐杆线虫的生殖率，具体方法为：取灭过菌的干净1.5ml离心管4-8个，每管中分别加入0.5-1.5ml尾水样品，再取含同步化36-60h秀丽隐杆线虫的培养皿，用无菌水冲洗培养皿，将秀丽隐杆线虫洗脱液转移至无菌的50ml离心管中，静置一段时间待秀丽隐杆线虫沉淀后，弃上清至管中剩余2ml液体，将管中秀丽隐杆线虫摇匀，吸取15-25μl液体分别加入到尾水样品中，放入15-25℃的生化培养箱中培养，12-48h后将离心管取出，挑出一条秀丽隐杆线虫放入含新鲜OP50的培养基上培养，使其产卵，每12-36h转移一次准备孕虫生长板，至秀丽隐杆线虫停止产卵，每种样品做4-6个平行样，待虫卵孵化成成虫后，统计板中秀丽隐杆线虫总数。
步骤(6)中对秀丽隐杆线虫的运动行为的的研究方法是取样4-8个典型污水处理厂的尾水样品，将同步化36-60h后的秀丽隐杆线虫暴露于尾水样品中，12-48h后统计暴露的秀丽隐杆线虫1min内头部摆动次数及20s内身体弯曲次数，具体方法为：取灭过菌的干净1.5ml离心管4-8个，每管中分别加入0.5-1.5ml尾水样品，取含同步化36-60h秀丽隐杆线虫的培养皿，用无菌水冲洗培养皿，将秀丽隐杆线虫洗脱液转移至无菌的50ml离心管中，静置待秀丽隐杆线虫沉淀后，弃上清至管中剩余2ml液体，将管中秀丽隐杆线虫摇匀，吸取15-25μl液体分别加入到尾水样品中，放入15-25℃生化培养箱中培养，12-48h后将离心管取出，挑出一条秀丽隐杆线虫放入干净不含食物的NGM培养基上，恢复1min后计算20s内线虫的身体弯曲次数，每种尾水样品做3-6个平行样，再取干净不含食物的NGM板中滴一滴无菌水，挑出一条秀丽隐杆线虫放入水中，恢复1min后统计lmin内头部摆动次数，每种尾水样品做3-6个平行样。
秀丽隐杆线虫的爬行轨迹为正弦曲线，假设秀丽隐杆线虫咽泵的方向为y轴，则对应在其爬行的x轴上每改变一次爬行方向记为一次身体弯曲;而头部摆动则为秀丽隐杆线虫头部摆动达到身体的一半定义为一次头部摆动。
步骤(6)中对秀丽隐杆线虫的世代周期的的研究方法是取样4-8个典型污水处理厂的尾水样品，将同步化36-60h后的秀丽隐杆线虫暴露于尾水样品中，12-48h后统计暴露的秀丽隐杆线虫的世代周期时间，具体方法为：取灭过菌的干净1.5ml离心管4-8个，每管中分别加入0.5-1.5ml尾水样品，取含同步化36-60h秀丽隐杆线虫的培养皿，用无菌水冲洗培养皿，将秀丽隐杆线虫洗脱液转移至无菌的50ml离心管中，静置待秀丽隐杆线虫沉淀后，弃上清至管中剩余2ml液体，将管中秀丽隐杆线虫摇匀，吸取15-25μl液体分别加入到尾水样品中，放入15-25℃生化培养箱中培养，12-48h后将秀丽隐杆线虫取出，挑出一条秀丽隐杆线虫放入含有食物的NGM培养基上，等待线虫产卵，当第一枚卵产出后，记下时间并挑出秀丽隐杆线虫，将虫卵放入生化培养箱培养，培养1-3天后，虫卵孵化生长为成虫，每隔1h观察一次，记录它产下第一个卵的时间，从而算出暴露秀丽隐杆线虫的世代周期时间，每种离子浓度处理3-6条秀丽隐杆线虫。
本发明的有益效果：运用模式生物——秀丽隐杆线虫对污水处理厂尾水进行毒性分析，通过对比空白对照组的线虫与暴露线虫的致死率、生殖率、运动行为和世代周期之间的差异，从而判断废水的综合毒性的大小。
