申请日2013.01.08
公开(公告)日2014.07.09
IPC分类号G01N21/31; G01N1/34; G01N1/40; G01N21/82
摘要
本发明公开了一种评估废水中抗生素的综合生物效能(效价当量)的方法，包括对废水采用比浊法测定吸光度，计算废水中抗生素的残留生物效能。本发明方法能够对废水中的不同抗生素及其具有抗菌活性基团的代谢产物进行准确测定，操作简便，从而能够对不同类型抗生素废水进行比较或是对含有多种抗生素的混合废水进行综合评价，而且对不同类抗生素废水的残留生物效能的评价具有普适性。
权利要求书
1.一种评估废水中抗生素的残留生物效能的方法，包括如下顺序进行的步骤：
1)采用比浊法筛选针对革兰氏阳性菌的标准参照抗生素，并获得革兰氏阳性菌-标准参照抗生素标准 曲线;
2)富集和纯化废水中的抗生素类物质，获得抗生素类富集物;
3)无菌水溶解抗生素类富集物后加入革兰氏阳性菌菌液，混匀，采用比浊法测定吸光度;
4)将测定得到的吸光度值代入革兰氏阳性菌-标准参照抗生素的标准曲线中，获得废水中抗生素类物 质的综合生物效能。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤1)中所述标准参照抗生素的筛选包括如下顺序进行的步骤：
1A)将革兰氏阳性菌接种于抗生素Ⅲ号培养基中，摇匀，培养，制得革兰氏阳性菌标准菌液，备用;
1B)精确称取抗生素标准品，溶解，配制成不同浓度的抗生素溶液，接着加入革兰氏阳性菌菌液，混 匀后在530nm波长下进行比浊测定，测定革兰氏阳性菌与不同浓度的抗生素溶液的混合液的吸光度值;
1C)以抗生素浓度的对数值为横坐标，以革兰氏阳性菌与抗生素的混合液的吸光度值为纵坐标绘制所 述革兰氏阳性菌-抗生素的标准曲线;
1D)根据得到的革兰氏阳性菌-抗生素的标准曲线，以标准曲线的斜率以及综合因子作为筛选依据， 筛选得到针对革兰氏阳性菌的标准参照抗生素为红霉素，其中所述综合因子为革兰氏阳性菌-抗生素的标准 曲线的线性浓度范围内的高浓度与低浓度比值与标准曲线的斜率之积。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤1A)中所述培养的温度为35-37℃。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤1A)中所述革兰氏阳性菌标准菌液在波长530nm处的吸光 度达到0.3-0.7。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征是所述革兰氏阳性菌选择金黄色葡萄球菌。
6.一种评估废水中抗生素的残留生物效能的方法，包括如下顺序进行的步骤：
(1)采用比浊法筛选针对革兰氏阴性菌的标准参照抗生素，并获得革兰氏阴性菌-标准参照抗生素标 准曲线;
(2)富集和纯化废水中的抗生素类物质，获得抗生素类富集物;
(3)无菌水溶解抗生素类富集物后加入革兰氏阴性菌菌液，混匀，采用比浊法测定吸光度;
(4)将测定得到的吸光度值代入革兰氏阴性菌-标准参照抗生素的标准曲线中，获得废水中抗生素类 物质的综合生物效能。
7.如权利要求6所述的方法，其特征是步骤(1)中所述标准参照抗生素的筛选包括如下顺序进行的步骤：
(1A)将革兰氏阴性菌接种于抗生素Ⅲ号培养基中，摇匀，培养，制得革兰氏阴性菌标准菌液，备用;
(1B)精确称取抗生素标准品，溶解，配制成不同浓度的抗生素溶液，接着加入革兰氏阴性菌菌液， 混匀后在530nm波长下进行比浊测定，测定革兰氏阴性菌与不同浓度的抗生素溶液的混合液的吸光度值;
(1C)以抗生素浓度的对数值为横坐标，以革兰氏阴性菌与抗生素的混合液的吸光度值为纵坐标绘制 所述革兰氏阴性菌-抗生素的标准曲线;
(1D)根据得到的革兰氏阴性菌-抗生素的标准曲线，以标准曲线的斜率以及综合因子作为筛选依据， 筛选得到针对革兰氏阴性菌的标准参照抗生素为四环素，其中，所述综合因子为革兰氏阴性菌-抗生素的标 准曲线的线性浓度范围内的高浓度与低浓度比值与标准曲线的斜率之积。
8.如权利要求7所述的方法，其特征是步骤(1A)中所述革兰氏阴性菌标准菌液在波长530nm处的吸光 度达到0.3-0.7。
9.如权利要求6或7所述的方法，其特征是所述革兰氏阴性菌选择大肠杆菌。
10.如权利要求1或6所述的方法，其特征是步骤2)中采用固相萃取法对废水进行富集和纯化，得到所 述抗生素类富集物。
说明书
一种评估废水中抗生素的残留生物效能的方法
技术领域
本发明属于抗生素的检测领域，特别涉及抗生素生产废水中残留抗生素及其相关物质的生物效能的评 估方法。
背景技术
抗生素的污染问题受到越来越多的重视，抗生素已经成为环境中普遍存在的污染物，不仅在土壤和地 表水中被频繁检出，在地下水甚至饮用水源中也有发现。其中，抗生素生产废水是抗生素进入环境的重要 来源之一。1995年Holm等人分析了一个废弃制药厂废物填埋场的地下水，结果磺胺类药物浓度达到5 mg/L;2008年我国一个调查发现土霉素生产废水经过处理后出水土霉素浓度达到50mg/L。抗生素生产废 水中残留抗生素及相关物质(主要是某些具有抑菌效应的异构体或水解与降解中间产物等)含量高，对废 水生物处理系统的影响也相当显著。因此抗生素生产废水的研究受到广泛的关注。
目前国内外对废水中抗生素的检测主要采用的是色谱法及其联用技术、毛细管电泳法等理化检测方 法。理化检测方法是利用抗生素分子中的官能团所具有的特殊反应或由其性质来测定含量，使用最广泛的 是相对成熟的液相色谱法及其联用技术。但是此方法适用于已知结构的抗生素及其代谢产物，需要有相应 的抗生素标准品才能进行定量，而抗生素生产废水在处理过程中会发生一系列的变化，产生不同的异构体 或水解与降解中间产物，这些产物中仍有部分会保留一定的抗菌活性甚至可能具有更高的抗菌活性，例如， 土霉素在弱酸条件下(pH值3-6.5)，土霉素能够降解成为去水土霉素(Anhydrooxytetracycline)和差向异 构土霉素(Epimeric-Oxytetracycline)，去水土霉素能够迅速不可逆地降解成为α-Apo-OTC和β-Apo-OTC， 强酸条件下，α-Apo-OTC和β-Apo-OTC能够进一步不可逆降解成为Ter-OTC;同时在较温和的中性和弱 碱条件下，土霉素可能产生更为复杂的降解过程，形成iso-OTC，N-DM-OTC，以及N-DDM-OTC等降解 产物;在碱性溶液中，土霉素的主要降解产物是Terranoic acid。差向异构土霉素、α-Apo-OTC和β-Apo-OTC 往往是土霉素的主要降解产物，而差向异构土霉素与土霉素的比例在0.4到0.6之间。这三种主要的降解 产物仍然具有部分抗菌作用，最低抑菌浓度(MIC)分别为1.0、32和>32mg/L，同时也有实验表明这三 种降解产物的生物毒性超过土霉素的生物毒性。
例如申请号为200810110955.7的发明专利申请公开了一种乳及乳制品中四环素类抗生素残留量的检 测方法。该方法利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定四环素类抗生素残留量。试样经 Na2EDTA-McIlvaine缓冲液(pH4.0)提取，三氯乙酸除蛋白，经HLB固相提取小柱净化和富集，采用色谱柱 分离，以标准品土霉素、四环素和金霉素配制含量为100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、 0ng/ml的标准溶液，在柱温30℃，以含有0.1%甲酸的水溶液(v/v)和乙腈为流动相进行梯度洗脱，采用多 反应监测方式进行定量。此法虽然快速、准确、灵敏度高，但是其适用范围仅用于测定土霉素、四环素和 金霉素三种四环素类抗生素的含量，对于其中可能出现的其他类抗生素以及相关的代谢中间产物则不能进 行检测。
本发明主要针对此问题，以抗生素中具有抑菌活性的有效成分即“效价”作为对象，检测废水中抗生 素的残留生物效能(抗生素及其相关物质的生物效能)。根据药典，抗生素效价常采用微生物检定法，是 利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理，如管碟法、比浊法、稀释法等，其中，管碟法是目前抗 生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗 透作用，比较标准品和待检品两者对试验菌的抑菌圈的大小来测定供试品的效价。2005年版《中国药典》 正式收录比浊法，与管碟法并列成为抗生素效价测定的标准方法之一。比浊法是利用抗生素在液体培养基 中对实验革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品 与供试品对实验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。国内已有基于比浊法的抗生素效价测 定仪，但是主要用于药品、制剂的纯度检验，还没有针对废水进行应用。
我国现行的药典中采用比浊法对部分药品或制剂进行效价纯度检测，但是其测定对象仍然是比较单纯 的某一抗生素药品或制剂，即药典中的效价方法的对象是单一抗生素药品制剂的检验，不涉及混合抗生素。 具体是针对某一种抗生素供试品与其标准品的对照来计算供试品的效价(供试品与标准品种类一致)，而 混合抗生素的效价由于没有比较的标准，因此还未见采用比浊法测定废水等环境样品的效价。
发明内容
本发明的目的是针对现有抗生素残留生物效价测定存在的技术的问题，提供一种具有普适性的废水中 抗生素的生物效能的评估方法，本发明方法能够对含有不同种类抗生素及具有抗菌活性基团的抗生素代谢 产物的废水的残留生物效能进行准确测定，操作简便，对不同类抗生素废水的残留生物效能的评价具有普 适性和通用性。
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种评估废水中抗生素的残留生物效能的方法，包括如下顺 序进行的步骤：
1)采用比浊法筛选针对革兰氏阳性菌(G+)的标准参照抗生素，并获得革兰氏阳性菌-标准参照抗生 素标准曲线;
2)富集和纯化废水中的抗生素类物质，获得抗生素类富集物;
3)用无菌水溶解抗生素类富集物后加入革兰氏阳性菌菌液，混合均匀，采用比浊法测定吸光度;
4)将测定得到的吸光度值代入革兰氏阳性菌-标准参照抗生素的标准曲线中，获得废水中抗生素类物 质的综合生物效能。
其中，所述革兰氏阳性菌选择金黄色葡萄球菌。
特别是，以抗生素浓度的对数值为横坐标，以革兰氏阳性菌与抗生素的混合溶液在波长为530nm处的 吸光度值为纵坐标绘制获得所述革兰氏阳性菌-标准参照抗生素标准曲线。
其中，步骤1)中所述标准参照抗生素的筛选包括如下顺序进行的步骤：
1A)将革兰氏阳性菌(G+)接种于抗生素Ⅲ号培养基中，摇匀，培养，制得革兰氏阳性菌标准菌液， 备用;
1B)精确称取抗生素标准品，溶解，配制成不同浓度的抗生素溶液，接着加入革兰氏阳性菌菌液(G+)， 混合均匀后在530nm波长下进行比浊测定，测定革兰氏阳性菌与不同浓度的抗生素溶液的混合液的浊度吸 光度值;
1C)以抗生素浓度的对数值为横坐标，以革兰氏阳性菌与抗生素的混合液的吸光度值为纵坐标绘制所 述革兰氏阳性菌-抗生素的标准曲线;
1D)根据得到的革兰氏阳性菌-抗生素的标准曲线，以标准曲线的斜率以及综合因子作为筛选依据， 筛选得到针对革兰氏阳性菌的标准参照抗生素为红霉素，其中所述综合因子为革兰氏阳性菌-抗生素的标准 曲线的线性浓度范围内的高浓度与低浓度比值与标准曲线的斜率之积。
其中，步骤1A)中所述培养的温度为35-37℃。
特别是，所述革兰氏阳性菌标准菌液在波长530nm处的吸光度达到0.3-0.7。
特别是，还包括将冷冻保藏的革兰氏阳性菌(G+)进行复活培养之后再接种到抗生素Ⅲ号培养基中， 培养制成所述的革兰氏阳性菌标准菌液。
尤其是，所述复活培养温度为35-37℃;培养时间为4-5h。
其中，步骤1B)中所述抗生素溶液的配制方法如下：首先将抗生素标准品按照表1所述方法配制成 抗生素标准储备液，然后再加入磷酸盐缓冲液，配制成相应的不同浓度的抗生素溶液。
表1 抗生素储备液的配制方法
特别是，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.8或6.0。
其中，步骤1C)中所述革兰氏阳性菌与抗生素的混合液的吸光度值选择向抗生素溶液中加入革兰氏 阳性菌菌液后在温度为37±1℃条件下培养150-210min的浊度吸光度值。
特别是，所述培养时间优选为200min。
其中，在步骤2)中采用固相萃取法(SPE)对废水进行富集和纯化，得到所述抗生素类富集物。
特别是，步骤2)中所述抗生素类富集物按照如下顺序进行的步骤制备而成：
2A)将废水通过固相萃取柱，使废水中抗生素类物质吸附在固相萃取柱上;
2B)对固相萃取柱进行洗脱，合并洗脱液;
2C)对洗脱液进行干燥，即得。
特别是，所述的固相萃取柱选择HLB柱。
尤其是，所述HLB柱选择用于萃取极性和非极性类化合物的Waters Oasis HLB、Strata-X固相柱; 对非极性和碱性化合物有专属性保留作用的Waters Oasis MCX、Strata-X-C固相柱;对非极性和强碱性 化合物有专属性保留作用的Waters Oasis WCX、Strata-X-CW固相柱;对非极性和弱酸性化合物有专属性 保留作用的Waters Oasis WAX、Strata-X-AW固相柱;对高极性化合物有非常好的保留作用，常用于吸附 各类样品的杂质和色素，pH范围0-14的Strata固相柱。
特别是，所述步骤2A)的废水过固相萃取柱之前，还包括将废水进行除杂处理，去除废水中的悬浮 物、金属离子等杂质;步骤2B)中采用二氯甲烷与丙酮的混合溶液洗脱四环素类抗生素;采用甲醇/乙酸 乙酯混合溶液或含有氨水的甲醇溶液洗脱大环内酯类抗生素;采用甲醇洗脱磺胺类抗生素。
其中，所述二氯甲烷与丙酮的混合溶液中二氯甲烷与丙酮的体积之比为3：2;其中所述甲醇/乙酸乙 酯混合溶剂中甲醇与乙酸乙酯的体积之比为1：1;所述含有氨水的甲醇溶液中氨水与甲醇的体积之比为1： 100。
尤其是，所述悬浮物采用GF/F滤纸过滤去除;所述金属离子采用Na2-EDTA去除。
本发明另一方面提供一种评估废水中抗生素的残留生物效能的方法，包括如下顺序进行的步骤：
(1)采用比浊法筛选针对革兰氏阴性菌(G-)的标准参照抗生素，并获得革兰氏阴性菌-标准参照抗 生素标准曲线;
(2)富集和纯化废水中的抗生素类物质，获得抗生素类富集物;
(3)用无菌水溶解抗生素类富集物后加入革兰氏阴性菌菌液，混合均匀，采用比浊法测定吸光度;
(4)将测定得到的吸光度值代入革兰氏阴性菌-标准参照抗生素的标准曲线中，获得废水中抗生素类 物质的综合生物效能。
其中，步骤(1)中所述革兰氏阴性菌(G-)选择大肠杆菌。
特别是，以抗生素浓度的对数值为横坐标，以革兰氏阴性菌与抗生素的混合溶液在波长为530nm处的 吸光度值为纵坐标绘制获得所述革兰氏阴性菌-标准参照抗生素标准曲线。
其中，步骤(1)中所述标准参照抗生素的筛选包括如下顺序进行的步骤：
(1-A)将革兰氏阴性菌(G-)接种于抗生素Ⅲ号培养基中，摇匀，培养，制得革兰氏阴性菌标准菌 液，备用;
(1-B)精确称取抗生素标准品，溶解，配制成不同浓度的抗生素溶液，接着加入革兰氏阴性菌，混 合均匀后在530nm波长下进行比浊测定，测定革兰氏阴性菌与不同浓度的抗生素溶液的混合液的浊度吸光 度值;
(1-C)以抗生素浓度的对数值为横坐标，以革兰氏阴性菌与抗生素的混合液的吸光度值为纵坐标绘 制所述革兰氏阴性菌-抗生素的标准曲线;
(1-D)根据得到的革兰氏阴性菌-抗生素的标准曲线，以标准曲线的斜率以及综合因子作为筛选依据， 筛选得到针对革兰氏阴性菌的标准参照抗生素为四环素，其中，所述综合因子为革兰氏阴性菌-抗生素的标 准曲线的线性浓度范围内的高浓度与低浓度比值与标准曲线的斜率之积。
其中，步骤(1-A)中所述培养的温度为35-37℃。
特别是，所述革兰氏阴性菌标准菌液在波长530nm处的吸光度达到0.3-0.7。
特别是，还包括将冷冻保藏的革兰氏阴性菌(G-)进行复活培养之后再接种到抗生素Ⅲ号培养基中， 培养制成所述的革兰氏阴性菌标准菌液。
尤其是，所述复活培养温度为35-37℃;培养时间为4-5h。
其中，步骤(1-B)中所述抗生素溶液的配制方法如下：首先将抗生素标准品按照表1所述方法进行 配制成抗生素标准储备液，然后再加入磷酸盐缓冲液，配制成相应的不同浓度的抗生素溶液。
特别是，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.8或6.0。
其中，步骤(1-C)中所述革兰氏阴性菌与抗生素的混合液的吸光度值选择向抗生素溶液中加入革兰 氏阴性菌菌液后在温度为37±1℃条件下培养150-210min的浊度吸光度值。
特别是，所述培养时间优选为200min。
其中，在步骤(2)中采用固相萃取法对废水进行富集和纯化，得到所述抗生素类富集物。
特别是，步骤(2)中所述抗生素类富集物按照如下顺序进行的步骤制备而成：
(2-A)将废水过固相萃取柱，使废水中抗生素类物质吸附在固相萃取柱上;
(2-B)对固相萃取柱进行洗脱，合并洗脱液;
(2-C)对洗脱液进行干燥，即得。
特别是，所述步骤(2-A)的废水过固相萃取柱之前，还包括将废水进行除杂处理，去除废水中的悬 浮物、金属离子等杂质;步骤(2-B)中采用二氯甲烷与丙酮的混合溶液洗脱四环素类抗生素;采用甲醇/ 乙酸乙酯混合溶液或含有氨水的甲醇溶液洗脱大环内酯类抗生素;采用甲醇洗脱磺胺类抗生素。
其中，所述二氯甲烷与丙酮的混合溶液中二氯甲烷与丙酮的体积之比为3:2;其中所述甲醇/乙酸乙酯 混合溶剂中甲醇与乙酸乙酯的体积之比为1:1;所述含有氨水的甲醇溶液中氨水与甲醇的体积之比为1:100。
尤其是，所述悬浮物采用GF/F滤纸过滤去除;所述金属离子采用Na2-EDTA去除。
本发明的有益效果是：
1、本发明方法能够测定废水中具有抗菌活性的抗生素及其具有药效官能团的代谢产物的总的生物效 能，包含未知结构的中间产物。
2、本发明方法具有普适性，能够对不同类型的抗生素废水以及含有多种抗生素的混合废水中的残留 生物效能进行统一的综合评价。
3、本发明方法中的标准抗生素对细菌传代不敏感、耐药菌少、不易受到外界环境影响，标准抗生素 的效价线性范围宽、重复性好，适用于对含有不同类型抗生素废水或含多种抗生素的混合废水的抗菌活性 进行综合评价。
4、本发明方法采用固相萃取技术对废水中的抗生素及其具有药效官能团的代谢产物进行富集、纯化， 去除其他能够促进或抑制微生物生长的物质，提高了评估的稳定性和准确性，准确反映废水的抗菌活性。
5、本发明方法简单易行，操作条件温和，操作步骤简单，常规检测设备均适用于本发明。
