申请日2011.10.26
公开(公告)日2012.05.09
IPC分类号C02F3/34; C12N1/14; C12R1/89; C12R1/66; C12R1/885; C12N1/12
摘要
一种真菌介导的微藻固定化废水处理方法，其特征是包括以下步骤：(1)微藻的转接;(2)微藻的高密度培养;(3)能成球真菌的孢子的培养;(4)添加新鲜孢子悬浮液到微藻培养基中;(5)真菌介导微藻细胞固定化;(6)固定化的微藻细胞用来处理各种废水。本发明引入了真菌介导的微藻固定化技术，用来处理废水，处理完的废水可回收利用，满足了微藻工业化处理废水应用的要求，是一条经济、高效地制微藻污水处理的新途径。
权利要求书
1.一种真菌介导的微藻固定化废水处理方法，其特征是包括以下步骤：(1)微藻的转接;(2)微藻的高密度培养;(3)能成球真菌的孢子的培养;(4)添加新鲜孢子悬浮液到微藻培养基中;(5)真菌介导微藻细胞固定化;(6)固定化的微藻细胞用来处理各种废水。
2.根据权利要求1 所述一种真菌介导的微藻固定化废水处理方法，其特征是所述的微藻包括小球藻属、筒柱藻属、硅藻、菱形藻、裂壶藻、杜氏藻属、栅藻、微绿球藻、衣藻属、扁藻、空球藻属。
3.根据权利要求1 所述一种真菌介导的微藻固定化废水处理方法，其特征是所述的微藻培养基包括BG-11培养基、F/2培养基、walne培养基、TAP培养基，以及其他任何经过修改的微藻培养基。
4.根据权利要求1 所述一种真菌介导的微藻固定化废水处理方法，其特征是所述的废水包括市政废水、工业废水、沼气发酵废水以及动物粪便废水。
5.根据权利要求1 所述一种真菌介导的微藻固定化废水处理方法，其特征在于，所述的能成球的真菌菌株包括米根霉、变色木耳、糙皮侧耳、羊肚菌、产黄青霉、双孢蘑菇、毛霉属、深黄被孢霉、海枣曲霉、里氏木霉、黄孢平革菌。
6.根据权利要求1所述一种真菌介导的微藻固定化废水处理方法，其特征是所述菌藻共生体的培养包含了为自养培养或异养培养的方法。
7.根据权利要求1所述一种真菌介导的微藻固定化废水处理方法，其特征是所述接种所述能成球的真菌的孢子数为1×102 L-1至1×1010 L-1。
8.根据权利要求6所述一种真菌介导的微藻固定化废水处理方法，其特征在于，所述的自养培养条件如下：温度控制在20-45℃的范围内，光照培养氮源甘氨酸或酵母提取物的初始浓度介于1-15 g.L-1，通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量50-300 L/h， CO2浓度0.9-3%;培养过程中采用10-200μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间;总培养时间介于50-400小时。
9.根据权利要求8所述一种真菌介导的微藻固定化废水处理方法，其特征在于，所述的自养培养条件如下：温度控制在28℃，光照培养氮源甘氨酸或酵母提取物的初始浓度为4 g.L-1，空气或空气与CO2的混合气体的通气量为80-120L/h，培养过程中pH值为7.0，总培养时间为120-200小时。
10.根据权利要求6所述一种真菌介导的微藻固定化废水处理方法，其特征在于，所述的异养培养条件如下：有机碳源葡萄糖浓度0.01-200 g.L-1，通入空气，通气量100-400 L/h，培养过程中采用5-40μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，总培养时间介于72-200小时。
11.根据权利要求10所述一种真菌介导的微藻固定化处理废水的方法，其特征在于，所述的异养培养条件如下：有机碳源葡萄糖浓度为20 g.L-1;通气量为150-250L/h，培养过程中pH值为7.0总培养时间为100-150小时。
说明书
一种真菌介导的微藻固定化废水处理方法
技术领域
本发明属于环境治理技术领域，特别涉及一种真菌介导的微藻固定化用来处理废水的工艺。具体说来就是在不同生长时期的微藻细胞中导入能成球的真菌孢子并控制培养条件，最终形成大颗粒的菌藻球体，进而利用真菌固定化的微藻处理废水的过程。
背景技术
随着工业进步和社会发展，排放的市政废水和，水污染日趋严重。现代污水处理方法主要分为物理处理法、化学处理法、物化处理法和生物处理法。相比较而言，生物处理污水由于适用范围广、投资和运行费用低，多年来已被确立为生活污水、城市混合污水、有机工业污水处理的主要手段之一，在生物法中利用藻类处理废水的研究早在20世纪50年代就有人报道。微藻是一种能进行光合作用的微生物。它可以利用废水中的氮、磷和吸收空气中大量的CO2，并合成脂肪，通过收集加工可提炼成生物柴油供汽车、火车作为动力燃料，进一步加工还可作为航空燃料，供飞机使用。因此利用微藻处理废水生物燃料优势明显繁殖速度比高等植物快40倍)，它在应对全球气候变暖和满足对非污染燃料的渴求方面都有着很大的潜力。
近几年来，国内外对进一步发挥藻类净化污水的潜力进行了大量研究，在藻类净化污水的机理研究方面取得了很大进展。与传统方法相比，利用藻类处理污水可以克服传统污水处理方法易引起的二次污染、潜在营养物质丢失、资源不能完全利用等弊端，同时能够有效且低成本地去除造成水体富营养化的氮、磷等营养物质，因此具有广阔的应用前景。
然后由于微藻的细胞很小(直径约2-70 μm)，处理完废水后，微藻的收集成为一个迄待解决的问题。而微藻固定化技术在污水处理方面的应用，使固定化的藻类具有藻细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、运行稳定可靠、微生物流失少、产物易分离、能纯化和保持菌株高效活力等优点，并且其在污水深度处理和氮磷去除方面也有独特的优点。
传统的固定化技术是指利用物理和化学手段将游离细胞定位于限定的空间区域并使其保持生物活性和可反复利用的一张基础技术。所用到的载体主要由有机和无机高分子材料已经复合载体等。这些载体的合成成本较高，难以满足微藻工业化处理废水的要求。本发明采用自然界广泛存在的真菌作为固定化材料，率先开展了利用真菌介导微藻成球从而帮助废水处理的研究。该方法简单高效，成本低廉，大大降低了微藻处理废水的成本。
发明内容
本发明的目的是提出一种真菌介导的微藻固定化废水处理方法。通过引入能成球的真菌孢子，形成真菌-微藻共生的大颗粒球体， 从而开发一种新型简单高效、成本低廉的微藻固定化废水处理工艺。
所述真菌介导的微藻固定化废水处理方法是以在生物反应器中高密度培养微藻细胞，然后通过添加能成球的真菌的孢子并控制培养获得真菌介导的微藻固定化细胞，并收集固定化的微藻细胞进行废水处理，按照如下步骤进行：(1)微藻的转接;(2)微藻的高密度培养;(3)能成球的真菌的孢子的培养;(4)添加新鲜孢子悬浮液到微藻培养基中;(5)真菌介导微藻细胞固定化;(6)固定化的微藻细胞用来处理各种废水。
所述的微藻细胞包括但不限于小球藻属(chlorella sp)，筒柱藻属(cylindrotheca sp. )， 硅藻(diatom)， 菱形藻(Nitzschia sp.)，裂壶藻( schizochytrium sp.)，杜氏藻属(dunaliella)，栅藻(Scenedesmus sp.)，微绿球藻(Nannochloris sp.)，衣藻属(chlamydomonas sp.)，扁藻(Tetraselmis sp.)，空球藻属(Eudorina sp.)等。
本发明中，所述的其特征是所述的微藻培养基包括但不限于BG-11 培养基、F/2 培养基、walne 培养基、TAP 培养基以及其他任何经过修改的微藻培养基。本发明中所述的废水包括，但不限于市政废水、造纸厂废水、糖蜜废水、啤酒厂废水等工业废水、沼气发酵废水以及动物粪便废水。
所述的能成球的真菌菌株包括，但不限于米根霉(Rhizopus Oryzae)，变色木耳(Anthracophyllum discolor)，糙皮侧耳(Pleurolus ostreatus)，羊肚菌(Morchella sp.)，产黄青霉( Penicillum chrysogenum)，双孢蘑菇(agaricus bisporus)，毛霉属(Mucorcircillenous)，深黄被孢霉(Mortierella isabellina)，海枣曲霉(Aspergillus phonecis)，里氏木霉(Trichoderma reesei)， 黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。
本发明中，所述菌藻共生体的培养包含了为自养培养或异养培养的方法。接种真菌孢子数为1×102 L-1至1×1010 L-1，pH范围为0.1-10，温度范围为4-45℃。异养培养基有机碳源浓度初始还原糖浓度范围为0.01-200 g.L-1。
本发明方法涉及的流程详细描述如下。
(1)微藻的转接。
从-70度冰箱取出冻存微藻藻株并用接种环刮取少许到固体斜面平板光照培养。
所述的自养培养条件如下：温度控制在20-45℃的范围内，以28℃为最佳;光照培养氮源如甘氨酸、酵母提取物等初始浓度介于1-15 g.L-1，优选4 g.L-1，通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量50-300 L/h，优选80-120L/h;CO2浓度0.9-3%。培养过程中采用10-200μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳;总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于50-400小时，优选120-200小时。
所述的异养培养条件如下：有机碳源如葡萄糖浓度0.01-200 g.L-1，优选20 g.L-1;通入空气，通气量100-400 L/h，优选150-250L/h;培养过程中采用5-40μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳;总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于72-200小时，优选100-150小时。
(2)微藻的高密度培养。
将平板培养物接种至生物反应器培养，在异养培养基中高密度培养;生物反应装置包括摇瓶、通气瓶、光生物反应器、发酵罐和开放培养池。在上述适宜条件培养，直到细胞对数生长期，细胞密度达到(106-1010以上)。
所述的自养培养条件如下：温度控制在20-45℃的范围内，以28℃为最佳;光照培养氮源如甘氨酸、酵母提取物等初始浓度介于1-15 g.L-1，优选4 g.L-1，通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量50-300 L/h，优选80-120L/h;CO2浓度0.9-3%。培养过程中采用10-200μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳;总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于50-400小时，优选120-200小时。
所述的异养培养条件如下：有机碳源如葡萄糖浓度0.01-200 g.L-1，优选20 g.L-1;通入空气，通气量100-400 L/h，优选150-250L/h;培养过程中采用5-40μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳;总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于72-200小时，优选100-150小时。
(3)能成球的真菌的孢子的培养。
从-70度冰箱取出冻存真菌菌株并用接种环刮取少许到固体平板培养4-7天，然后用无菌水反复冲洗获得新鲜的真菌孢子。
(4)添加新鲜孢子悬浮液到微藻培养基中在微藻细胞培养到细胞对数生长期，细胞密度达到(106-1010以上)，向微藻的培养基中添加一定数量的真菌孢子。以海枣曲霉(Aspergillus. Sp)为例，添加1×102 L-1至1×1010 L-1的新鲜孢子到微藻的培养基中，优选1×104 L-1的真菌孢子浓度并以微藻异养的条件培养。为防止微藻与真菌共生成球的过程中引起的杂菌污染，所有操作均在无菌工作台中进行。
(5)真菌介导微藻细胞固定化。
优化培养条件，致使直至所有微藻与真菌形成微藻共生的球体。形成微藻共生球体的微藻，用简单的过滤方法进行微藻收获。
(6)固定化的微藻细胞用来处理各种废水。
收获的固定化微藻用来处理各种来源的废水，包括工业废水、沼气发酵废水以及动物粪便废水。
上述异养培养基配方为：K2HPO4·3H2O 0.04g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L， CaCl2·2H2O 0.036g/L， Citric acid 0.006g/L，Ferric ammonium citrate 0.006g/L，EDTA 0.001g/L，NaNO3 1.5g/L，Na2CO3 0.02g/L，A5微量元素液1.5ml/L，其中A5微量元素液组成：H3BO3 2.86g/L， MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.222g/L，NaMoO4·2H2O 0.39g/L，CuSO4·5H2O 0.079g/L 和CoCl2·6H2O 0.05g/L，并加入有机碳源至初始还原糖浓度为0.01-200g.L-1;优选范围在1-20 g.L-1。
本发明是通过在即将收获的微藻培养基中引用能成球的真菌菌株并混合培养，从而达到真菌-微藻共生并成球的目的，最后通过简单的过滤方法即可收获真菌介导的固定化微藻细胞(如图1所示)，然后采用该种微藻固定化技术高效处理废水并可通过简单过滤方法回收固定化细胞及净化废水。该工艺可以用来进一步满足大规模工业化废水处理并大大降低成本。
本发明的有益效果在于本发明引入了真菌介导的微藻固定化技术，用来处理废水。处理完的废水又可以回收利用，满足了微藻工业化处理废水应用的要求，是一条经济、高效地制微藻污水处理的新途径。
