申请日2011.10.14
公开(公告)日2012.04.11
IPC分类号C02F3/34
摘要
一种用于化工废水处理的生物活性预警标记方法。具体包括：提取污水处理系统活性污泥中微生物基因组总DNA，同时通过富集培养的方法筛选菌种并对其进行鉴定;用细菌16SrDNA的V6-V8区通用引物扩增微生物基因组总DNA;对PCR产物进行PCR-DGGE分析，建立正常运行系统下的群落演替模式;找到系统中与COD变化密切相关的菌株，使用RAPD技术得到菌株纯培养菌株的特异分子标记基因;通过功能菌特异分子标记基因的PCR，能够直接判断功能菌的存在情况，对污水处理系统进行监控。本发明解决了目前污水处理系统不能有效稳定运行的难题，该方法用于监控污水处理系统的运行情况，操作简便快速、能有效监控污水处理系统的运行状况。
权利要求书
1.一种用于化工废水处理的生物活性预警标记方法，其特征在于该方法包括：
(1)提取污水处理系统各反应池中的活性污泥中微生物基因组总DNA，同时通过富集培养的方法筛选菌种并对其进行鉴定;
(2)筛选PCR-DGGE引物：分别为V3区、V6-V8区、V9区通用引物，及优化变性剂范围和电泳时间;
(3)用细菌16S rDNA的V6-V8区通用引物扩增微生物基因组总DNA的V6-V8区;
(4)对PCR产物进行PCR-DGGE分析，并对图谱中的条带进行测序分析;
(5)通过PCA载量分析找到载量较大的DGGE条带，这些条带代表的微生物是系统运行中的功能性微生物，并对其进行鉴定;同时结合步骤(1)中筛选到的菌株，找到系统中与COD变化密切相关的菌株，该菌株能够用于判断系统运行情况;
(6)使用RAPD技术得到菌株纯培养菌株的特异分子标记基因，通过功能菌特异分子标记基因的PCR，能够直接判断功能菌的存在情况，对污水处理系统进行监控。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的基因组总DNA的提取方法是：
①样品预处理：分别量取各反应池中的30mL活性污泥样品，10000rpm，4℃离心5min，弃上清液;沉淀中加入100mL的TENP buffer，TENP buffer的组成为50mM Tris、20mM EDTA、100mM NaCl、1%PVP及pH=10，加4粒灭菌的玻璃珠，旋涡振荡2min，同上离心操作，弃上清液;加入100mL的生理盐水，洗涤两次;
②细胞裂解：将预处理后的污泥样品分别称取0.2g装入1.5mL的EP管，加入600uL的Extraction Buffer，Extraction Buffer的组成为100mM Tris、100 mM EDTA、200 mM NaCl、2%CTAB及pH8.0，旋涡振荡5min，再加入600uL的SDS Buffer，SDS Buffer的组成为100mM的Tris、200mM的NaCl、2%SDS及pH8.0，上下颠倒5min;
③反复冻融：将EP管放入-80℃冰箱15min，50℃水浴2min，重复3次;
④去蛋白：加入等体积的酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的溶液抽提蛋白至无蛋白层出现为止，吸取上清液加入新的EP管，加入等体积的氯仿：异戊醇=24：1的溶液除去残留的酚，15000rpm，3min，吸取上清液;
⑤DNA分离纯化：加入等体积的异丙醇沉淀DNA，15000rpm，6min，弃上清，沉淀中加入500mL的70%乙醇洗涤干燥，将沉淀溶于40uL的TE buffer，TE buffer的组成为pH=8.0，10mM pH8.0的Tris-Cl，1mM pH8.0的EDTA，-20℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)所述的PCR程序为：
PCR反应为50 μL体系，组成为：含2.5 mM Mg2+的10×PCR buffer 5 μL;2.5 mM 的dNTPs 5 μL;20 mM的上游引物V6-8F-GC 1 μL;20 mM的下游引物V6-8R 1 μL;模板DNA 1～10 ng;Taq酶0.5 μL;最后加超纯水至50 μL;
PCR程序为Touchdown PCR：94℃预变性5 min;94℃变性1 min，65℃复性1 min，72℃延伸1 min，之后每两个循环降低1℃，共20个循环;94℃变性1 min，55℃复性1 min，72℃延伸1 min，共15个循环;最后72℃延伸10 min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)所述具体操作为：
胶浓度为6%，组成为丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=37.5:1;变性梯度范围为30%～70%，变性剂的配制方法为100%的变性剂中含有7 mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺;在组成为20 mM Tris，10 mM冰乙酸，0.5 mM EDTA，pH7.4的1×TAE缓冲液中，60℃，160V运行4 h;电泳结束后，用1mg/L的EB溶液对凝胶染色15min，脱色3min;用凝胶成像系统对凝胶进行分析，所得图像用Bio-Rad Quantity One软件进行分析处理。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)所述具体操作为：
使用SPSS软件，通过其PCA载量分析找到载量较大的DGGE条带，并对其测序进行分子生物学鉴定;找出DGGE图谱中条带亮度变化与COD降解效率变化相关的条带，从这些条带中得到的DNA序列就能够用来跟踪和检测与系统COD去除效率相关的微生物菌种;通过对污水处理系统中的菌种进行分离纯化鉴定得到纯菌株，将其与微生物基因组总DNA进行PCR-DGGE分析。
说明书
一种用于化工废水处理的生物活性预警标记方法
技术领域
本发明涉及的是一种用于化工废水处理的生物活性预警标记方法，可以应用于污水处理系统运行情况的监测，属于环境微生物分子生态学领域。
背景技术
废水的生物处理不投加药剂，没有二次污染;在温和的条件下经过酶催化可高效、相对彻底的完成，处理费用低廉;对废水水质要求宽泛;处理效果良好，不仅去除了有机物、病原体、有毒物质等，还能去除臭味，提高透明度，降低色度等。对于污水处理系统，通常通过对水质的监测来保证污水处理系统的稳定运行，如控制和监控水质的化学参数(如COD、NH3-N、NO3-N、PO43--P和溶解氧)和物理参数(如水力停留时间)，实现废水的达标处理。但是仅仅通过控制和监控水质的化学和物理参数，并不能保证处理系统的高效长期稳定运行，特别是高含盐综合化工废水，具有高含盐量、高浓度、难降解、水质变化大的特点，如果对运行参数控制不当的话，极易引起系统的不稳定，从而影响废水的达标排放，对环境造成一定的影响。在废水的生物处理中，微生物是处理系统的主体，因此需要从微生物入手，通过对微生物群落的组成、丰度、分布及功能菌进行监测，结合功能菌株的分子标记技术对污水处理系统进行监控预警，通过微生物群落空间群落结构的演替规律及功能菌株的变化监测系统运行状况，提前调整系统运行参数，保证污水处理系统的稳定运行。
变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)技术可以分辨1个碱基的差异，广泛应用于微生物生态学及微生物多样性研究，该检测手段灵敏快捷，避免了传统上耗时的菌种分离，可进一步鉴定出传统方法无法分离出来的菌种。
随机扩增多态性DNA技术(Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD)作为一种新的DNA指纹图谱分析法，不仅具有常规PCR技术快速、安全、简便、灵敏等特点，而且其引物具有通用性，不需预先明确靶基因的核苷酸序列。
目前有利用PCR-DGGE技术分析废水处理中微生物群落构成的专利申请，如上海交通大学发明的工业废水处理中的功能菌群特异分子检测方法(CN1995389，公开日2007年7月11日);同济大学提出的分析城市污水厂污泥微生物群落构成的方法(CN1584051，公开日2005年2月23日);哈尔滨工业大学提出的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方法(CN101440406A)。上述专利分别涉及污水处理中功能菌的检测方法和微生物群落组成的分析方法，对促进污水处理系统的稳定运行有积极作用，但是未将污水处理系统群落结构变化与功能菌的检测结合起来应用于污水处理系统。污水处理系统作为整体运行，仅通过对系统中功能菌或者微生物群落结构的组成分析，不能有效监控污水处理系统的运行情况。将污水处理系统中微生物群落结构变化检测和功能菌检测结合起来，通过系统生物活性预警，调整系统中微生物组成，对污水处理系统进行监控来保证污水处理系统的稳定运行。目前还没有废水处理中微生物群落结构及功能菌的专利研究报道。
发明内容
本发明的目的在于针对综合化工废水中微生物群落结构及功能菌检测存在的空白，提出了一种用于化工废水处理的生物活性预警标记方法。通过PCR-DGGE技术与RAPD技术的结合，监控污水处理系统的运行状况，提前诊断处理系统的运行状况，解决了现有技术中的不足。
本发明提供的用于化工废水处理的生物活性预警标记方法包括：
(1)提取污水处理系统各反应池中的活性污泥中微生物基因组总DNA，同时通过富集培养的方法筛选菌种并对其进行鉴定;
(2)筛选PCR-DGGE引物：分别为V3区、V6-V8区、V9区通用引物，及优化变性剂范围和电泳时间;
(3)用细菌16S rDNA的V6-V8区通用引物扩增微生物基因组总DNA的V6-V8区;
(4)对PCR产物进行PCR-DGGE分析，并对图谱中的DNA条带进行测序分析;
(5)通过PCA载量分析找到在群落演替中载量较大的DGGE条带，这些条带代表的微生物是系统运行中的功能性微生物，并对其进行鉴定;同时结合步骤(1)中筛选到的菌株，找到系统中与COD变化密切相关的菌株，该菌株可用于判断系统运行情况;
(6)使用RAPD技术得到菌株纯培养菌株的特异分子标记基因，通过功能菌特异分子标记基因的PCR，能够直接判断功能菌的存在情况，对污水处理系统进行监控。
步骤(1)所述的基因组总DNA的提取方法是：
①样品预处理：分别量取各反应池中的30mL活性污泥样品，10000rpm，4℃离心5min，弃上清液;沉淀中加入100mL的TENP buffer(TENP buffer的组成为50mM Tris、20mM EDTA、100mM NaCl、1%PVP及pH=10)，加4粒灭菌的玻璃珠，旋涡振荡2min，同上离心操作，弃上清液;加入100mL的生理盐水，洗涤两次;
②细胞裂解：将预处理后的污泥样品分别称取0.2g装入1.5mL的EP管，加入600uL的Extraction Buffer，Extraction Buffer的组成为100mM Tris、100 mM EDTA、200 mM NaCl、2%CTAB及pH8.0，旋涡振荡5min，再加入600uL的SDS Buffer，SDS Buffer的组成为100mM的Tris、200mM的NaCl、2%SDS及pH8.0，上下颠倒5min;
③反复冻融：将EP管放入-80℃冰箱15min，50℃水浴2min，重复3次;
④去蛋白：加入等体积的酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的溶液抽提蛋白至无蛋白层出现为止，吸取上清液加入新的EP管，加入等体积的氯仿：异戊醇=24：1的溶液除去残留的酚，15000rpm，3min，吸取上清液;
⑤DNA分离纯化：加入等体积的异丙醇沉淀DNA，15000rpm，6min，弃上清，沉淀中加入500mL的70%乙醇洗涤干燥，将沉淀溶于40uL的TE buffer，TE buffer的组成为pH=8.0，10mM pH8.0的Tris-Cl，1mM pH8.0的EDTA，-20℃保存备用。
步骤(3)所述的PCR程序为：
PCR反应为50 μL体系，组成为：含2.5 mM Mg2+的10×PCR buffer 5 μL;2.5 mM 的dNTPs 5 μL;20 mM的上游引物V6-8F-GC 1 μL;20 mM的下游引物V6-8R 1 μL;模板DNA 1～10 ng;Taq酶0.5 μL;最后加超纯水至50 μL;
PCR程序为Touchdown PCR：94℃预变性5 min;94℃变性1 min，65℃复性1 min，72℃延伸1 min，之后每两个循环降低1℃，共20个循环;94℃变性1 min，55℃复性1 min，72℃延伸1 min，共15个循环;最后72℃延伸10 min。
步骤(4)所述具体操作为：
胶浓度为6%，组成为丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=37.5:1;变性梯度范围为30%～70%，变性剂的配制方法为100%的变性剂中含有7 mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺;在组成为20 mM Tris，10 mM冰乙酸，0.5 mM EDTA，pH7.4的1×TAE缓冲液中，60℃，160V运行4 h;电泳结束后，用1mg/L的EB溶液对凝胶染色15min，脱色3min;用凝胶成像系统对凝胶进行分析，所得图像用Bio-Rad Quantity One软件进行分析处理。
步骤(5)所述具体操作为：
使用SPSS软件，通过其PCA载量分析找到载量较大的DGGE条带，并对其测序进行分子生物学鉴定;找出DGGE图谱中条带亮度变化与COD降解效率变化相关的条带，从这些条带中得到的DNA序列就能够用来跟踪和检测与系统COD去除效率相关的微生物菌种;通过对污水处理系统中的菌种进行分离纯化鉴定得到纯菌株，将其与微生物基因组总DNA进行PCR-DGGE分析。
本发明的优点和积极效果：
本发明解决了目前化工废水处理系统不能有效稳定运行的难题，通过微生物群落结构变化和功能菌的变化监测，可提前调整系统运行参数，避免了在系统运行出现问题后再进行调整，从而保证处理系统的连续稳定运行，节约了大量的人力物力。该方法用于监控难降解化工废水污水处理系统的运行情况，操作简便快速、能有效监控污水处理系统的运行状况。
