微藻污水处理技术以藻细胞为主体代谢利用污水中的C、N、P等物质，该过程增殖的藻细胞既可用于生物质能源生产又可作为工业原料提取藻蛋白、微生物絮凝剂等，另外藻类光合作用过程对CO2的吸收也被认为是实现大气碳固定的可行途径。尽管微藻污水处理技术自提出已有50多年的历史，但工艺和理论研究仍十分薄弱，诸如分离采收困难、细胞密度低等问题极大地限制了该技术的发展和应用。
微藻细胞较小、带负电荷、密度接近于水等固有属性的限制使得藻细胞在水中往往处于稳定的悬浮状态，很难像活性污泥那样通过重力沉淀实现分离。然而自然界中存在絮凝性藻类，1965年Golueke等发现池塘中的微藻在温度较高且光线充足的时候能自然形成絮体。此后很多研究都证实了该现象的存在，目前基本认为微藻自絮凝是由两种机制引发的：(1)高pH条件下钙、镁等离子形成带正电的沉淀物，起到电性中和作用从而引发絮凝，(2)部分藻种在生理活动中产生具有絮凝作用的胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances，EPS)，EPS起到生物絮凝剂的作用从而引发絮凝。一些研究认为微藻絮体的形成过程也有絮凝性细菌的作用。微藻自絮凝能改善藻细胞沉降性、提高沉淀效率，然而自絮凝机理研究的相对缺乏极大限制了微藻污水处理技术的应用。因此研究微藻自絮凝特性及机理，对解决微藻污水处理技术应用中存在的藻细胞分离采收难题具有重要意义。
以往研究表明，小球藻表现出对各种污水环境良好的适应性、出色的污水处理效能和一定的油脂生产能力，但对小球藻自絮凝特性及机理研究相对不足，尤其对应用于污水处理的小球藻自絮凝特性缺乏了解。本文研究了污水处理小球藻自絮凝现象、絮体特性，初步探究了污水处理小球藻自絮凝机理，以期促进微藻污水处理技术的理论发展和实际应用。
一、材料与方法
1.1 藻种
从中国科学院淡水藻种库购买藻种，主要研究能在污染水体中生存、分布广泛、具有产油能力的Chlorellavulgaris(FACHB-8)作为研究藻种。用BG11(+N)培养基进行富集培养，以稳定期藻细胞作为接种藻种，接种到BG11(+N)、模拟生活污水中进行试验研究。
1.2 模拟生活污水
2模拟生活污水以乙酸钠(CODCr浓度为230~260mg/L)、NH4Cl(NH+4-N浓度为90~100mg/L)、KH2PO4(PO3-4-P浓度为7~9mg/L)分别作为有机碳源、氮源、磷源配制模拟生活污水，添加包含Mg、Ca、Fe、Zn、B、Mn、Cu、Co、Mo等微量元素的化学试剂，初始pH值控制在7.5~8.0。
1.3 光-SBR反应器及运行
采用两个SBR反应器平行运行，分别命名为M1(BG11培养基，灭菌，透气封口膜封闭)、M2(模拟生活污水，不灭菌，透气封口膜封闭)。有效容积为500mL，置于磁力搅拌器上，搅拌速度为500r/min。将装置整体置于光照培养箱中，培养条件：温度为(25±1)℃，光照强度为2000lux，光暗时间比为13∶11。SBR运行周期为48h，沉淀时间为30min，排水比为60%。
1.4 微藻形态观察
常规形态：采用生物显微镜(BX-51，Olympus，Japan)及数码像机(SX600，Cannon，Japan)进行。
扫描电子显微镜观察，从反应器中取出部分微藻，离心后去除上清液，加入2.5%戊二醛置于4℃冰箱中固定1.5h。用磷酸缓冲液冲洗3次，每次10min，分别用体积浓度为50%、70%、80%和90%的乙醇进行脱水，每次10~15min，100%的乙醇脱水3次，每次10~15min。乙醇：乙酸异戊酯=1∶1、100%乙酸异戊酯各置换一次，每次15min，用临界点干燥仪(HCP22，Hitachi，Japan)对样品进行干燥，将样品观察面向上粘贴在扫描电镜样品台上，用离子溅射镀膜仪(IB-5，Giko，Austria)在样品表面镀一层1500nm厚的金膜，将处理好的样品用扫描电子显微镜(S-4300，Hitachi，Japan)进行拍照观察。
1.5检测方法
COD、NH+4-N、PO3-4-P、MLSS等指标采用国家规定的标准方法测定。沉淀效率计算如式(1)。
二、结果
2.1 微藻絮体形态变化
试验过程中不同底物条件下微藻絮体形态变化如图1所示，M1与M2接种藻种相同，均为BG11(+N)培养基富集后稳定期的小球藻。接种到BG11(+N)培养基-M1和模拟生活污水-M2中后，微藻聚集形态发生了明显区别：M1中藻细胞密度增加、聚集形态仍为游离状态为主，没有发生藻细胞的聚集、粘附乃至絮凝，M2中运行到第20d就出现了类似活性污泥絮体的松散絮体结构，藻细胞粘附在絮体上，此后生物量进一步增加、絮体进一步增大，第60d时，M2中出现较为密实、尺寸较大的絮体。
2.2 沉淀效率变化
试验过程M1和M2中微藻沉淀效率变化如图2所示。0~10d，两个反应器中微藻沉淀效率基本保持不变，该阶段为微藻的适应期。15d后，M2中微藻沉淀效率明显改善，从0~10d的平均33.83%提高到80.40%(55~60d)，M1中微藻沉淀效率也有所提高，但沉降性依然较差，从0~10d的平均31.74%提高到43.03%(55~60d)。上述结果表明，短沉淀时间能改善微藻沉降性、提高沉淀效率，并且对开放的微藻污水处理系统中微藻沉淀效率的提高作用更加明显。
2.3 微藻显微结构
如图3所示，对M1、M2中的小球藻进行扫描电镜观察，以研究微藻絮体及内部显微结构。从M1中小球藻细胞的扫描电子显微镜照片，可以看出，细胞表面较为光滑、没有其他形态的藻类、细菌生长。M2中微藻絮体的扫描电子显微镜照片显示，藻细胞表面较为粗糙，粘附一些丝状、胶状物质(胞外聚合物)，藻细胞黏附在絮体上，絮体内部充满大大小小的孔隙。絮体内部除了球状藻细胞外，没有观察到其他形态的藻细胞，但有大量的短杆菌、球菌。由于M1对基质进行灭菌处理、透气封口膜封闭运行，因此保持了单一的微藻种群，M2中未对模拟生活污水进行灭菌处理，运行过程滋生了大量细菌，扫描电镜照片表明这些细菌在藻细胞絮凝过程中具有重要作用。
2.4 絮体元素含量变化及成分分析
对M1、M2中小球藻进行扫描电镜观察的同时，利用能谱仪同步分析了主要元素的变化，结果如表1所示。由表1可知，基质条件的不同造成M1、M2中生物质元素含量具有明显区别，M1中具有相对较高的Cl、K元素含量，而M2中具有相对较高的Na、P、Fe、Mg、Ca元素含量。P、Fe、Mg、Ca元素是污水处理系统中形成无机物沉淀的主要元素，对微藻絮体的沉降性具有改善作用。
如图4所示，微藻絮体XRD图谱分析结果，与Jade6.0软件中的标准文档进行比较可知，衍射图谱中大部分强峰与Ca4O(PO4)2一致。结合能谱分析结果，Ca、P元素在微藻自凝聚中具有重要作用。
三、讨论
关于微藻自絮凝机理，目前比较公认的是两种机制：(1)高pH条件下Ca、P等离子形成带正电的沉淀物，形成电性中和作用从而引发絮凝，(2)部分藻种在生理活动中产生具有絮凝作用的EPS，EPS起到生物絮凝剂的作用从而引发絮凝。近年来，许多研究发现菌藻共生体系中微藻具有良好的絮凝性，逐渐发展出絮凝性细菌辅助微藻絮凝的理论。
3.1 高pH诱导絮凝
1984年，Sukenik等首次定量、系统性地研究了高pH下的微藻自絮凝现象，认为磷酸钙是诱导自絮凝的关键沉淀物。Vandamme等在研究小球藻自絮凝时发现pH显著影响絮凝效果。Sirin等在研究三角褐指藻的自絮凝时发现，pH值为10.5~11时生成的沉淀物主要为镁沉淀物。上述研究将微藻自絮凝视为纯粹的化学反应过程，忽略了微藻生理生化过程引起的絮体内部微环境pH改变以及细胞分泌物对藻细胞絮凝特性的影响。本研究中观察到以模拟生活污水为底物的M2中具有相对较高的Na、P、Fe、Mg、Ca元素含量，已有研究表明，P、Fe、Mg、Ca元素在活性污泥絮凝、好氧颗粒化中具有重要作用。基于该微藻自絮凝机理，P、Fe、Mg、Ca元素在微藻絮体的形成中具有重要作用，但作用机制可能不仅限于pH条件改变引起的化学沉淀。
3.2 EPS引发絮凝
EPS是微生物细胞外一层黏性基质，直接影响细胞表面特性，与废水处理反应器中微生物聚集体的形态、结构、功能及生态均密切相关，在废水生物处理中起重要作用。Zhang等研究表明，磷浓度能增加藻细胞生长和胞外有机物分泌。Boonchai等发现，饥饿处理后会引起微藻EPS产量的增加，氮饥饿条件下的微藻EPS具有相对较高的蛋白质含量。He等发现，Mg2+/Ca2+能改变微藻EPS中蛋白质的含量和类型，从而促进藻细胞在硅片表面的粘附。Salim等发现，EPS在E.texensis细胞的自凝聚中起主要作用，细胞表面粘附的主要物质为糖蛋白。Ge等发现，EPS中糖类/蛋白质比能更好地反映微藻沉降性能，而不是简单的EPS总量。这些研究表明EPS对微藻细胞表面特性、絮凝性能的影响十分显著。M2中微藻细胞表面的丝状、胶状物质就是胞外聚合物，因此，有必要从EPS的角度研究微藻自絮凝机理，探究EPS在微藻颗粒化过程中的作用机制。
上述两种自絮凝机制能较好地解释实验室纯培养条件下一些微藻的自絮凝现象，然而近年来在微藻污水处理系统的研究中，越来越多的证据表明细菌在微藻自絮凝过程中具有重要作用。
3.3 絮凝性细菌辅助絮凝
菌藻共生体系的絮凝现象很早就引起研究人员的注意。Lee等研究发现，Flavobacterium、Terrimonas、Sphingobacterium对Chlorellavulgaris培养物絮凝活性影响显著。一些丝状真菌也具有良好的与藻细胞结合的能力，例如Rhizopusoryzae、Penicilliumexpansum和Mucorcircinelloides等与微藻共培养，在实验室优化条件下可形成较大的颗粒(直径为2~5mm)。M2中扫描电镜照片观察到絮体内部具有大量的短杆菌、球菌，表明这些细菌在藻细胞絮凝过程中具有重要作用。
开放的污水处理系统中具有非常复杂的微生物群落结构，相应地构成复杂菌藻共生体系。微藻与细菌关系主要有两类，互利共生-相互利用代谢产物、竞争抑制-对营养物质的相互竞争。如何利用菌藻之间的互利共生关系，较好地构建菌藻系统是将其应用于污水处理的前提之一。本研究中细菌的分子生物学鉴定、菌-藻关系以及菌藻共生体形成机理有待进一步研究。
本研究中微藻自絮凝的现象无法以上述任一单一机理进行解释，尤其对开放的微藻污水处理系统，其作用过程包括藻-藻、菌-藻、菌-菌以及微藻、细菌与污水中物质的多重作用。另外微藻、细菌生理生化过程对微环境条件的改变也十分复杂，因此有必要对微藻絮凝特性、过程以及机理进行进一步深入研究，以便进一步明确微藻自絮凝机理，从而指导微藻污水处理技术的发展应用。
四、结论
(1)以短沉淀时间运行，环境选择压力下小球藻在模拟生活污水中会发生自絮凝，沉降性良好。
(2)污水处理小球藻藻细胞表面粗糙，粘附丝状、胶状物质，絮体中含有大量短杆菌、球菌。
(3)污水处理小球藻具有相对较高的Na、P、Fe、Mg、Ca元素含量，絮体无机物质中主要形态为Ca4O(PO4)2。
(4)污水处理小球藻自絮凝是在短沉淀构成的环境选择压力诱导下，综合胞外聚合物诱导絮凝、无机元素沉淀促进絮凝以及絮凝性细菌辅助絮凝共同作用的结果。（来源：枣庄学院城市与建筑工程学院；临沂大学资源环境学院；北京工业大学建筑工程学院）
