再生水回用是解决现代城市缺水问题的有效途径之一。城市污水处理厂的二级出水中仍含有一定浓度的氮和磷，若直接用作城市景观水体补水极易引发水体富营养化。若再生水用于补充地下水，则可能造成地下水硝酸盐污染。过量的硝酸盐进入人体会导致输氧的血红蛋白变成高铁血红蛋白，丧失携氧能力，严重甚至会导致窒息。传统二级处理出水C/N极低，需要投加外部碳源以实现进一步脱氮，此过程不仅导致处理成本增加，同时还存在碳源过量的二次污染风险。
硫自养反硝化生物滤池因为成本低，且反应过程中无需投加碳源等优点而被广泛关注，其脱氮原理主要是生物膜上的微生物在缺氧环境下以还原态硫为电子供体对硝酸盐进行反硝化，因此滤池正常运行的前提是滤料表面生物膜的培养和形成。目前，反硝化脱硫菌（NR-SOB）的应用研究主要集中于脱氮硫杆菌，但该菌生长缓慢，且对温度、盐度的耐受性不强，实际应用潜力有限。可见，合适的挂膜启动方式对于硫自养反硝化技术的工程应用具有重要意义。
当前硫自养反硝化的脱氮负荷较低，一般在0.12~0.60kg/（m³·d）左右。此外，硫自养反硝化微生物易受到进水水质等环境因素影响，造成出水水质波动。硫源对于反硝化脱氮效果也有较大影响，升华硫和硫代硫酸钠为硫源的脱氮效果优于生物硫。但受制于成本及危险化学品规定限制，纯硫磺滤料无法在工程中直接应用。所以笔者采用新开发的含硫复合填料进行实验。
目前，针对硫自养反硝化生物滤池合适的挂膜启动方式还未见详细研究报道。以北京某再生水厂二沉池出水作为实验进水，对比了变滤速接种挂膜、固定滤速自然挂膜和变滤速自然挂膜三种启动方式对硫自养反硝化生物滤池脱氮效果稳定性的影响，同时考察了反应过程中DO、pH和SO42-等参数的变化情况，从而确定适宜的挂膜方法。结合高通量测序技术和硝酸盐氮的去除机制，探讨不同挂膜条件下硫自养反硝化系统中的微生物群落结构，以期为复合硫填料反硝化应用于工程的挂膜启动提供参考。
1、材料与方法
1.1 实验装置
反应器由4组相同的滤柱组成（如图1所示），滤柱直径为150mm、总高为1000mm，其中，底部承托层为150mm高的砾石（直径为30～50mm），滤料层高为350mm。滤料采用含硫复合滤料。滤料堆积密度为0.8～1.1g/cm3，粒径为5～15mm，比表面积为30.1m2/g，填充体积为6180cm3。滤池采用上向流设计，二沉池出水通过蠕动泵从底部进水口进入，经过生物滤池填料净化后从上部的出水口排出。
1.2 接种污泥和原水水质
接种污泥取自北京某再生水厂A2/O工艺的二沉池回流污泥，悬浮固体（MLSS）浓度为8000mg/L。所用原水为二沉池出水，NO3--N、NO2--N、SO42-、DO分别为8.92~16.27、0~0.5、68.62~136.51、1.91~7.97mg/L，浊度为0.56~2.21NTU，pH为6.74~8.07。
1.3 实验方法
反应器的启动分为三种方式：固定滤速自然挂膜、变滤速自然挂膜和变滤速接种挂膜，氮去除量达到10mg/L时调整空床停留时间（EBCT），由120min逐渐缩短至20min，1#、2#、3#不接种污泥，4#接种1L二沉池回流污泥。其中，1#、2#采用固定滤速自然挂膜，EBCT分别为30、20min，相应的进水氮负荷为0.58、0.86kg/（m³·d）；3#采用变滤速自然挂膜，EBCT依次为120、60、45、40、30min，对应的进水氮负荷为0.14、0.29、0.38、0.43、0.58kg/（m³·d）；4#采用变滤速接种挂膜，EBCT依次为120、60、45、40、30、20min，对应的进水氮负荷为0.14、0.29、0.38、0.43、0.58、0.86kg/（m³·d）。
1.4 分析方法
水样经0.22μm滤膜过滤后进行水质分析，NO3--N、NO2--N、SO42-：赛默飞ICS-1100离子色谱，温度、pH、DO：WTW/Multi3420测定仪。1.5高通量测序分析取北京市某再生水厂二沉池回流污泥和稳定运行阶段的挂膜滤料（变滤速接种挂膜和变滤速自然挂膜）送往上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序分析。滤料取自滤料层的中部，对样品16SrRNA的V3-V4区进行扩增，所用引物为338F与806R。
2、结果与讨论
2.1 固定滤速自然挂膜
分别以EBCT为30、20min启动反应器，分析运行25d的NO3--N去除情况和NO2--N的生成情况，结果见图2。两种情况下的平均脱氮负荷分别为0.37、0.35kg/（m³·d），平均氮去除率分别仅为65.59%和41.48%，无法达到相关研究0.75kg/（m³·d）的脱氮负荷。在EBCT=30min的情况运行到第8～15天时，平均氮去除量为10.1mg/L，说明反硝化菌在挂膜初期也有脱氮效果。在EBCT=20min下运行，系统仅在第8天和15天出现氮去除量大于10mg/L的现象。两种情况下都存在出水水质不稳定和亚硝酸盐积累的现象，说明在自然挂膜初期反硝化菌的脱氮性能极易受到环境因素影响，需要合适的恒化培养环境。
2.2 变滤速自然挂膜
2.2.1 变滤速自然挂膜启动分析
在整个变滤速自然挂膜阶段，在1～16、17～22、23～51、52～65、66～104和105～120d，调整EBCT分别为120、60、45、40、30、20min（即第一～六阶段），运行结果见图3。在每个时间段，出水NO3--N浓度先升高后降低，出水NO2--N浓度在调整初期会出现部分积累，最大积累量为5.92mg/L。
在第一阶段，出水NO3--N从12.70mg/L逐渐降低至2.12mg/L，但是在第7天升至7.63mg/L，说明在挂膜初期脱氮效果不稳定，易受环境影响。第二阶段的氮去除量有所增加，可稳定在10mg/L以上且无NO2--N积累，平均氮去除率为95.22%，表明硫杆菌等脱氮菌的生物量比上一阶段有所增加，氮去除量主要受制于底物浓度。
在第三和第四阶段，氮去除量随进水水质波动，挂膜培养时间分别需要29d和14d，EBCT为40min情况下的微生物培养时间短于EBCT为45min的，分析原因可能是EBCT降低，单位时间进水硝酸盐量增加。
在第五阶段，调整流速初期出现NO2--N积累，7d后达到最大值5.92mg/L，随后逐渐降低，24d后完全消失。运行25d后，氮去除量连续3d可达10mg/L以上，随后有所降低。
在第六阶段，进水水质波动较小，进水NO3--N最大变化量为3.8mg/L，进水NO2--N均小于0.01mg/L，平均氮去除量为10.21mg/L，氮去除率达到90%以上，其间达到最大脱氮负荷即0.81kg/（m³·d）。
2.2.2 不同EBCT的脱氮效果比较
根据挂膜后稳定运行7d的进出水水质数据，计算不同空床停留时间下的平均氮去除量和脱氮负荷，结果见图4。
在EBCT为120、60、45、30、20min的条件下，对应的平均氮去除量分别为11.27、10.97、8.69、9.63、9.76mg/L，在空床停留时间缩短并培养稳定后，氮去除量的变化不明显。在EBCT=45min时，脱氮负荷增加量不大，这可能是由于实验期间水温变化使氮去除量降低导致的。各空床停留时间下的脱氮负荷分别为0.14、0.26、0.28、0.46、0.71kg/（m³·d），脱氮负荷随空床停留时间缩短、流速增大而逐渐增加。
2.3 变滤速下两种挂膜方式的脱氮效果比较
在变滤速接种挂膜的情况下（见图5），分别在第9、26和66天调整空床停留时间，最终在EBCT=30min时平均氮去除量为7.88mg/L，最大脱氮负荷为0.52kg/（m³·d），平均氮去除率为66.86%。
对比接种挂膜（见图5）和自然挂膜（见图3）的脱氮效果，接种挂膜在初期可以较早地达到10mg/L的氮去除量，比自然挂膜早9d，说明污泥中存在好氧菌，能更快地消耗进水溶解氧，为上层滤料微生物提供缺氧条件。后续调整EBCT的时间接近，表明是否接种污泥对后期生物膜的生长速率没有影响。在EBCT为30min的运行工况下，接种挂膜的氮去除量低于自然挂膜，且在进水水质相对稳定的条件下，脱氮效果也不如自然挂膜稳定。
对比不同空床停留时间下亚硝酸盐积累情况，改变空床停留时间后接种挂膜和自然挂膜均会出现亚硝酸盐积累的现象，说明在提高进水负荷以后微生物的生长随着底物浓度的增加产生变化。硝酸盐还原酶Nar的合成速率可能高于亚硝酸盐还原酶Nir，导致Nar对电子的竞争能力高于Nir，在有限的空床停留时间内亚硝酸盐还原不彻底，故出现出水亚硝酸盐积累。随着微生物和酶逐渐培养成熟，完成亚硝酸盐还原过程，亚硝酸盐含量逐渐降低。在EBCT为45min时，两种挂膜方式的亚硝酸盐消失时间相同，亚硝酸盐积累量小于1mg/L所需的时间均为10d；在EBCT为30min时，自然挂膜的亚硝酸盐消失时间比接种挂膜晚3d。
刘玲花等接种纯脱氮硫杆菌株去除地下水中的硝酸盐，发现当滤料中同时存在脱氮硫杆菌和异养反硝化菌时，接种纯脱氮硫杆菌株意义不大，控制合适的pH、温度和停留时间即可，本实验结果进一步证明了此结论。
2.4 运行参数对脱氮效果的影响
2.4.1 DO对脱氮效率的影响
DO对反硝化有很大影响，主要是由于DO和NOx--N竞争电子供体。在氧分压较低的情况下，反硝化作用为微生物的生长提供替代产能途径；氧分压过高会抑制硝酸盐还原酶的合成及活性。相关研究认为脱氮硫杆菌是一类兼性厌氧菌，在好氧条件下其优先利用氧为电子受体，反硝化过程受到抑制；在缺氧或厌氧条件下，脱氮硫杆菌利用硝酸盐作为电子受体，完成生物反硝化过程。
自然挂膜反应器出水口的平均DO为0.19mg/L（见图6），仅在启动初期出现较高的DO，挂膜阶段的进水DO平均为5.25mg/L，挂膜初期的氮去除量较低，出水DO剩余3.24mg/L，说明部分硫杆菌在好氧情况下利用氧为电子受体抑制了反硝化过程。在挂膜后期，虽然进水DO均大于6mg/L，但依然具有明显的脱氮效果，表明反应器下层填料生物膜中存在好氧菌，先消耗了进水中的DO，为上层的生物膜创造了缺氧环境。
2.4.2 pH变化
考察了变滤速自然挂膜运行周期内NO3--N去除量与pH变化量的关系，结果见图7。pH变化量随NO3--N去除量的增大而增加。pH会改变底物和菌体酶蛋白的带电状态，从而影响细菌对营养物质的吸收以及代谢过程中酶的活性。合适的进水pH可保证生物自养反硝化所需要的还原性环境，根据其反应方程式，自养反硝化1mgNO3--N需要消耗4.57mg碱度（以CaCO3计）。
pH变化量不能完全反映碱度变化，但有学者发现当pH为6.5~8.0时，NO3--N去除速率均在3.1mg/（L·h）以上，硫杆菌能取得较为满意的反硝化效果。本实验进水pH范围为6.74~8.07，平均NO3--N去除速率为28.92mg/（L·h），表明该再生水厂二沉池出水满足自养反硝化过程中的碱度消耗，无需控制进水pH。
2.4.3 氮去除量对硫酸盐浓度的影响
硫自养反硝化过程中硫单质提供电子供体被氧化成SO42-，由于市政污水排放标准对硫酸盐浓度没有具体要求，《生活饮用水卫生标准》（GB5749—2022）要求SO42-不超过250mg/L，该装置出水SO42-最大值为224.78mg/L，平均值为157.3mg/L，克服了一般硫自养反硝化出水SO42-过高的问题。图8（a）反映了挂膜过程中去除单位无机氮产生SO42-量（SO42-/ΔTIN）的变化情况。参照硫自养反硝化反应方程式，SO42-/ΔTIN的理论值为7.54，实际平均值为9.42，说明反应器中主要进行的是硫自养反硝化过程。
由图8（b）可知，挂膜过程中去除单位TIN产生的SO42-量并非完全与理论值相同，在第17～23、38～44、78～83、88～94、100~105天出现实际值低于理论值的现象，推测可能的原因有：反应器中存在异养反硝化；硫氧化不完全生成了副产物，比如SO32-、S2O32-等；硫酸盐还原菌（SRB）利用水中的有机物将SO42-还原为S2-。在运行过程中也出现了高于理论值的现象，其主要出现在启动初期和调整滤速后，分析原因可能为：进行不完全的反硝化，TIN去除量没有增加，但该过程中消耗电子供体；一些好氧菌利用水中微量溶解氧将硫单质氧化为SO42-。
2.5 微生物群落结构解析
2.5.1 变滤速接种和自然挂膜的微生物群落
变滤速接种挂膜和自然挂膜两种方式培养的生物膜中，在门水平上占比较多的为变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、浮霉菌门（Planctomycete），丰度分别为58.12%、9.98%、15.49%、3.41%和71.66%、14.64%、5.44%、2.51%，与前人研究的硫自养反硝化系统微生物群落一致。
变形菌门中大部分微生物可以利用氢、氨、甲烷和挥发性脂肪酸等进行反硝化作用。绿弯菌门的某些菌属被发现有异养特性，可利用系统中溶解性微生物产物作为碳源将NO3--N转化为NO2--N，反映了NO3--N在反应器中的去除过程。拟杆菌门的部分微生物具有降解高分子化合物（纤维素、蛋白质和脂类等）为简单有机物并还原NO3--N的能力，说明反应器中可能存在异养反硝化菌利用污泥中的内碳源进行协同反硝化，一定程度上解释了SO42-的产生量低于理论值的现象。此外，酸杆菌门（Acidobacteriota）也被证明有脱氮基因（两种方式下的丰度分别为2.24%和1.06%），具有相应的反硝化能力。
另外，在属水平上，Dokdonella、Thiobacillus、Comamonadaceae、Terrimonas、SBR1031、Thermmonas、Ferritrophicum、Ferruginibacter、Xanthomonadaceae、A4b、others（丰度<1.0%都归为others）的相对丰度分别为21.13%、10.94%、2.45%、2.82%、5.41%、2.66%、2.67%、1.26%、2.62%、2.57%、48.04%和31.49%、6.38%、6.82%、4.04%、1.43%、3.86%、3.66%、3.82%、2.48%、1.52%、34.49%。硫杆菌属（Thiobacillus）是以还原态硫为电子供体还原NO3-、NO2-的专性化能自养菌，其相对丰度较大，说明系统内进行硫自养反硝化过程，和TIN去除量与SO42-产生量关系的分析结果一致。接种挂膜（10.94%）的硫杆菌属占比高于自然挂膜（6.38%）。
孤岛杆菌（Dokdonella）中部分微生物为严格异养和好氧菌，有学者曾在需要曝气的同步硝化反硝化工艺中检出，孤岛杆菌的检出验证了滤池底部存在好氧菌消耗进水DO的猜想，自然挂膜中的孤岛杆菌丰度高于接种挂膜，说明自然挂膜方式更易去除进水中的溶解氧，为硫杆菌创造缺氧环境，解释了自然挂膜滤池的脱氮负荷高于接种挂膜的现象。
此外在生物膜中也检测到了具有硫自养反硝化功能的热单胞菌属（Thermomonas）细菌，其在接种挂膜法和自然挂膜法系统中的相对丰度分别为2.66%和3.86%。
2.5.2 二沉池回流污泥的微生物群落
二沉池回流污泥中主要优势菌属不动杆菌属（Acinetobacter）和Tetrasphaera菌属的相对丰度分别为16.22%和10.46%（见图9）。Acinetobacter是活性污泥中常见的好氧菌，解释了接种挂膜初期较早达到10mg/L氮去除量负荷的现象。Tetrasphaera菌属可以进行反硝化，将硝酸盐还原至亚硝酸盐但不能完全反硝化至氮气。硫杆菌属和热单胞菌属在二沉池回流污泥中含量较低，均未检出，说明在两种挂膜方法的反应器中均存在明显的菌种驯化过程。从另一个角度看，由于都需要重新驯化硫自养反硝化相关菌属，那么采用二沉池回流污泥的接种挂膜法和自然挂膜法相比，在操作上多了运输污泥的步骤，故此方法在实际工程中没有显著优势。
3、结论
①固定滤速挂膜会出现亚硝酸盐积累和脱氮效果不稳定的问题，硫自养反硝化工艺用于实际工程时，在保证出水水质的前提下，建议采用变滤速自然挂膜。
②变滤速自然挂膜的脱氮负荷最高可达0.81kg/（m³·d），高于变滤速接种挂膜的0.52kg/（m³·d）。在改变水力停留时间后接种挂膜和自然挂膜均会出现亚硝酸盐积累的现象，在稳定运行期间，自然挂膜的脱氮负荷优于接种挂膜。
③针对实际二沉池出水，进水溶解氧过高会抑制脱氮过程，对于pH无需额外控制，SO42-实际产生量略高于理论值。
④反应器中进行硫自养反硝化的细菌在属水平上主要有Thiobacillus和Thermomonas属，相对丰度分别为6.38%和3.86%，其与二沉池回流污泥相比存在明显的驯化过程。接种挂膜和自然挂膜过程都需要重新驯化硫自养反硝化相关菌属，接种挂膜在实际工程应用中没有显著优势。（来源：北京工业大学北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室，北京城市排水集团有限责任公司，北京城市排水集团有限责任公司科技研发中心）
