生物破乳剂的主要制备过程可分为生产菌的筛选、发酵生产、提取和纯化。
1.生物表面活性剂的种类及生产菌
生物表面活性剂已有20多年的发展历史,通过发酵,在一定条件下的微生物细胞可生产生物表面活性剂。按结构特点,生物表面活性剂基本上可以分为6大类。
2.分离生物表面活性剂生产菌的方法
生物表面活性剂的生产首先依赖于生产菌,不同的生产菌产生不同的生物表面活性剂,如何快速而有效地筛选和分离出表面活性剂生产菌,是人们研究的一个热点,现有菌株的筛选和分离主要有以下几种方法。
(1)表面张力法
生物表面活性剂具有表面活性,因此可通过检测微生物的液体培养液是否具有表面活性来筛选生物表面活性剂产生菌。这种方法在菌种初筛过程中比较麻烦,但却能很好地反映出菌株在一定培养条件下产生生物表面活性剂的能力。
(2)界面张力法
因为生物表面活性剂能降低油水间界面张力,通过界面张力仪和其他仪器检测菌体培养液加入前后油水两相间界面张力的变化来确定菌体产生生物表面活性剂能力的大小。能降低油水间界面张力的即为生物表面活性剂的产生菌。此法也是一种有效检测菌体产生生物表面活性剂能力大小的方法。
(3)血平板法
血平板法是利用生物表面活性剂的溶血特性来筛选产生生物表面活性剂的菌株。血平板培养基可采用在普通的细菌、真菌培养基加入一定浓度的羊血灭菌后制成平板,通过平板划线或涂平板的方法将富集培养液接种于血平板上,培养几天后挑取有溶血圈的菌落作进一步的研究。这种方法的优点是比较方便直观,可以用大量的菌种筛选工作,根据溶血圈与菌落之比来判断菌体产生生物表面活性剂的能力;缺点是如果血平板制作不好则不易发现溶血圈,直接影响到实验结果的观察。
(4)原油平板法
表面活性剂具有两亲性或乳化原油的特性,因此,可以通过菌体在原油平板形成乳化圈的大小来确定菌种是否产生生物表面活性剂以及其产生生物表面活性剂的能力大小。这种方法非常适合也只适合能利用石油烃类物质产生生物表面活性剂的微生物。
(5)液滴法
液滴法是利用96孔板快速大量检
测表面活性剂生产菌的一种方法。此法可以检测菌体产生生物表面活性剂的数量和质量。该法具有结果明显易观察的特点,同时可以进行多个样品的测量,但缺点是样品准备比较麻烦。
(6)傅里叶变换红外光谱法
不同的生物表面活性剂结构不同,但它们都至少存在酯键或羟基基团,这些基团常使化合物在红外光谱中有很强的光吸收能力。所有的生物表面活性剂由于有C!O的存在,在1720cm-1和1770cm-1有强的吸收峰,因此,可以用来判断菌体是否产生生物表面活性剂。傅里叶变换红外光谱法被证明是一种快速有效的方法,在测量时加入内标物,可以定量的测量生物表面活性剂的产量。但这种筛选方法较为复杂,不适合大规模的菌种筛选工作。具体联系污水宝或参见http://www.dowater.com更多相关技术文档。
生物表面活性剂的提取
目前,生物表面活性剂工业规模的应用与合成的表面活性剂相比并不具有优势,主要由于生物表面活性剂的生产费用较高,而产物提取费用占生产费用的大部分。生物表面活性剂在发酵液中的低浓度和两亲性妨碍其有效分离,常用提取方法有以下几种。
(1)萃取
溶剂萃取是一种常用的提取方法,常用萃取有机溶剂有甲醇、乙醇、戊烷、丙酮、氯仿、二氯甲烷,这些溶剂可单独使用,也可混合使用。MariasKuyukina等用甲基-叔丁基醚萃取Rhodococcus产生的生物表面活性剂,结果表明,甲基-叔丁基醚作为萃取剂可以取得较高的产品收率(10g/L),高效率(临界胶束浓度为130~170mg/L),同时产品具有良好的表面活性(表面张力和界面张力分别为29mN/m和0.9mN/m)。甲基-叔丁基醚具有低毒、可生物降解、易回收、不易燃及不易爆炸等优良特性。(2)结晶与沉淀
结晶与沉淀是利用样品组分中各组分在溶剂中的溶解度差异,使某些组分从溶液中生成结晶分离出来,是纯化物质的一种很有效的方法,用离心或过滤取出沉淀物,必要时可再溶解后,用重结晶或重沉淀进一步纯化。如Emulsm或由Torulopsis-petrophilum生产的蛋白质乳化剂均可以由在上清液中加入(NH4)2SO4沉淀得到。
(3)超滤
超滤是基于一种半透性薄膜,使溶液中的某些组分通过,而阻止或截留其他组分的分离方法。这种方法速度快、回收率高,在国外应用较为广泛。Sung-chyrLin等用分子量截止值(MWCO)为30000D的超滤膜对Bacilluslicheniformis的变异体产生的生物表面活性剂进行了提取分析,同时还使超滤和高效液相色谱相结合,设计了一套对生物表面活性剂的提取、分析方法。
(4)泡沫分离
微生物的发酵过程中都会产生泡沫现象,产生表面活性物质的过程中尤其显著。泡沫是由于快速搅动及向好氧微生物培养液中充氧而产生的,在表面活性物质存在的情况下稳定下来。利用这些泡沫来回收表面活性物质,可能是一种既经济又合理的方法。Davis等用泡沫分离法对一类生物表面活性剂Surfactins进行了提取和浓缩,证明了泡沫分离是一种有效的生物表面活性剂分离方法,而且使泡沫分离和发酵过程相结合,建立了连续的生产过程。
(5)柱色谱
柱色谱法是基于混合物组分在固定相和流动相之间分配平衡的差异而实现的,柱色谱法一般与萃取和薄层色谱配合使用,如从发酵液中分离提纯鼠李糖脂,可得到较纯的物质。
(6)薄层色谱法
薄层色谱法是把吸附剂平铺在一种载体上成一薄层作固定相,以不同的溶剂做流动相,靠吸附中的毛细现象,沿着一定方向移动,使样品中的各组分在薄层中的吸附剂和展开剂之间,由于吸附与解吸的性质差异而得以相互分离。薄层色谱法可以对生物表面活性剂定性和定量的分析,但通常需要花费大量的时间进行预纯化,如沉淀和有机萃取。
(7)高效液相色谱
高效液相色谱法是用极细颗粒的填充物作为固定相,采用高压泵输送流动相,是一种具有很高分离效率的仪器分析法。其突出的优点是分析速度快、柱效高、检测灵敏度高、定量分析的准确度高。SungChyrLin[13]等人提出了一种分析和纯化生物表面活性剂的改进高效液相色谱方法,通过比较原培养液、超滤滤液及在原培养液中加入甲醇后的超滤滤液的色谱图,在没有任何生物表面活性剂结构信息的情况下,就可以鉴定相应生物表面活性剂的峰。适用于生物表面活性剂化学结构的表征及物理性质的鉴定。分离、提纯生物表面活性剂的方法多种多样,往往不是单一的方法,而是根据实际情况,使用几种方法,这样可以得到较好的效果。
