申请日2013.12.24
公开(公告)日2014.04.02
IPC分类号C12N15/10
摘要
本发明属于环境分子生物学技术领域，涉及一种高效提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，取活性污泥离心，弃上清，然后向离心管内加入灭菌玻璃珠和贮存液Ⅰ，将离心管管盖拧紧后置于旋涡混合器击打，离心弃上清，磷酸盐缓冲液洗涤;加入贮存液Ⅱ温育;加入TRIzol，漩涡振荡后离心取上清，加入氯仿，漩涡振荡，室温放置并离心取上清，加入异丙醇，-20℃放置后离心弃上清，加入75%乙醇洗涤沉淀，离心弃上清，风干沉淀，贮存液Ⅲ溶解核酸沉淀，加入DNase I(RNase free)和RNase抑制剂，采用RNA纯化试剂盒纯化RNA。简化了微生物总RNA提取步骤，实现了快速、高效的提取厌氧颗粒污泥的微生物总RNA。
权利要求书
1.一种提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，包括下列步骤：
1)取活性污泥于灭菌离心管中离心;
2)弃上清，然后向离心管内加入灭菌玻璃珠和贮存液Ⅰ，将离心管管盖拧紧后置于旋涡 混合器击打3～8min以解絮凝并洗涤污泥除去腐殖酸，离心;
3)弃上清，重复步骤2)处理1次后，用磷酸盐缓冲液PBS洗涤污泥1次;
4)取步骤3)预处理后的污泥，加入贮存液Ⅱ于30～40℃温育5～15min;
5)加入TRIzol，漩涡振荡3～8min后，离心;
6)取上清，加入氯仿，漩涡振荡10～20s后，室温放置1～4min并离心;
7)取上清，加入异丙醇，-20℃放置15～25min，离心;
8)弃上清，加入75%乙醇洗涤沉淀后，9000～11000r/min离心3～8min;
9)弃上清，风干沉淀，用贮存液Ⅲ溶解核酸沉淀后，加入DNase I(RNase free)25～35U 和RNase抑制剂35～40U，并于30～40℃作用10～20min，进一步采用RNA纯化试剂盒纯化 RNA。
2.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤1)和 2)所述离心为，7000～9000r/min，3～8℃条件下离心3～8min。
3.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤2)所 述灭菌玻璃珠的直径为2～3mm，灭菌玻璃珠的加入量为0.2～0.4g/ml活性污泥;贮存液Ⅰ的 加入量为1～2mL/ml活性污泥。
4.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤3)中， 将离心管管盖拧紧后置于旋涡混合器击打5min以解絮凝并洗涤污泥除去腐殖酸，步骤4)中 贮存液Ⅱ的加入量为100μL/100μL预处理后的污泥;步骤4)中于37℃温育10min。
5.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤5)所 述的TRIzol加入量为0.5～1.5mL/100μL预处理后的污泥。
6.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤5)、 6)和7)所述的离心为9000～11000r/min离心8～12min。
7.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤6)中， 氯仿加入量为150～240μL/100μL预处理后的污泥;
步骤7)中，异丙醇加入量为150～240μL/100μL预处理后的污泥;
步骤8)中10000r/min离心5min。
8.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤9)中 贮存液Ⅲ的加入量为20～40μL/100μL预处理后的污泥。
9.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤9)中 加入DNase I(RNase free)30U和RNase抑制剂40U，并于37℃作用15min。
10.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，所有耗 材都要经过DEPC处理及高压灭菌。
说明书
一种高效提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法
技术领域
本发明属于环境分子生物学技术领域，具体涉及一种高效提取厌氧颗粒污泥微生物总 RNA的方法。
背景技术
活性颗粒污泥是由以细菌为主的微生物与悬浮物质、胶体物质、腐殖质等混杂在一起所 形成的茶褐色絮凝体,其中微生物是废水生物处理过程的主体,它们生理状态的好坏直接影 响着处理效果。活性颗粒污泥具有高度的生物多样性且成分极其复杂,不仅含有重金属、腐 殖酸等有机污染物,还存在大量核糖核酸酶(RNase)，因此从活性污泥中提取RNA存在一定难 度。近年来,随着分子生物学技术的迅速发展,对活性污泥中微生物种群的多样性、功能基因 的表达与处理效果之间关系的研究越来越受到环境微生物工作者的重视。
已有研究表明，通过分子生物学手段展开活性污泥中微生物的有关研究主要基于DNA 水平进行，但从DNA水平上检测到的微生物多样性、丰度等微生物生态分析不受存活力、 代谢状况和环境条件等因素的影响，不能反映真实状态，而在RNA水平上进行的微生物种 群分析与基因的表达分析则更能真实地体现分析时的状况，因而提取高质量的RNA是在基因 表达水平上研究废水生物处理过程活性污泥中微生物菌群变化及关键调控基因表达规律的必 要条件。关于RNA的提取方法，国内外已做过大量的研究报道，主要包括Trizol法、异硫氰 酸胍法、酚-SDS法等，但这些方法只能从一般的细菌、动物、植物等材料中提取获得较好 质量的RNA，对成分复杂的活性污泥不太适用。目前已报道的环境样品RNA提取方法主要 是针对土壤、沉积物等,而活性颗粒污泥与这些环境样品的特性不同，不仅生物量大，而且 存在菌胶团，因此这些方法并不太适用成分复杂的活性污泥。尽管国外有文献报道冻融法、 珠磨法、试剂盒法等能从土壤、沉积污泥、活性污泥等样品中提取出RNA，但这些方法都有 各自的缺点,冻融法很费时,珠磨法需要特殊的仪器珠磨机,试剂盒的价格昂贵,均难以用于 大量样品的分析，此外,国内关于活性污泥中RNA的提取方法鲜见报道。另外,不同的提取 方法获得的微生物群落基因多样性及其种类、丰度均不同。因而寻找一种操作简便、成本低 廉且适合于提取活性颗粒污泥总RNA的方法，全面反映微生物多样性，对于利用分子生物学 手段研究活性污泥中的微生物生态、功能基因及表达具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、有效、高质量的可用于厌氧颗粒污泥的微生物总RNA提 取的方法。该方法具有RNA提取总量多、纯度高、降解程度低、完整性好、具有丰富的生物 多样性。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种高效提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，包括下列步骤：
1)取活性污泥于灭菌离心管中离心;
2)弃上清，然后向离心管内加入灭菌玻璃珠和贮存液Ⅰ，将离心管管盖拧紧后置于旋涡 混合器击打3～8min以解絮凝并洗涤污泥除去腐殖酸，离心;
3)弃上清，重复步骤2)处理1次后，用磷酸盐缓冲液PBS洗涤污泥1次;
4)取步骤3)预处理后的污泥，加入贮存液Ⅱ于30～40℃温育5～15min;
5)加入TRIzol，漩涡振荡3～8min后，离心;
6)取上清，加入氯仿，漩涡振荡10～20s后，室温放置1～4min并离心;
7)取上清，加入异丙醇，-20℃放置15～25min，离心;
8)弃上清，加入75%乙醇洗涤沉淀后，9000～11000r/min离心3～8min;
9)弃上清，风干沉淀，用贮存液Ⅲ溶解核酸沉淀后，加入DNase I(RNase free)25～35U 和RNase抑制剂35～40U，并于30～40℃作用10～20min，进一步采用RNA纯化试剂盒纯化 RNA。
优选的，步骤1)和2)所述离心为，7000～9000r/min，3～8℃条件下离心3～8min;优 选的，步骤1)和2)所述离心为，8000r/min，4℃条件下离心5min。
优选的，步骤2)所述灭菌玻璃珠的直径为2～3mm，灭菌玻璃珠的加入量为0.2～0.4g/ml 活性污泥;贮存液Ⅰ的加入量为1～2mL/ml活性污泥;更优选的，灭菌玻璃珠的加入量为0.3 g/ml活性污泥;贮存液Ⅰ的加入量为1.4mL/ml活性污泥;优选的，步骤3)中，将离心管管盖 拧紧后置于旋涡混合器击打5min以解絮凝并洗涤污泥除去腐殖酸，
步骤3)所述的磷酸盐缓冲液PBS为磷酸盐缓冲液，PH为7.4，组成：NaCl137mmol/L， KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L。
优选的，步骤4)中贮存液Ⅱ的加入量为100μL/100μL预处理后的污泥;优选的，步骤4) 中于37℃温育10min。
优选的，步骤5)所述的TRIzol加入量为0.5～1.5mL/100μL预处理后的污泥;更优选的， 步骤5)所述的TRIzol加入量为1mL/100μL预处理后的污泥;TRIzol为一种总RNA抽提试剂， 其主要成分为苯酚。
优选的，步骤5)、6)和7)所述的离心为9000～11000r/min离心8～12min;更优选的， 步骤5)、6)和7)所述的离心为10000r/min离心10min。
优选的，步骤6)中，氯仿加入量为150～240μL/100μL预处理后的污泥;更优选的，步 骤6)中，氯仿加入量为200μL/100μL预处理后的污泥。
优选的，步骤7)中，异丙醇加入量为150～240μL/100μL预处理后的污泥;更优选的， 步骤6)中，异丙醇加入量为200μL/100μL预处理后的污泥。
优选的，步骤8)中10000r/min离心5min。
优选的，步骤9)中贮存液Ⅲ的加入量为20～40μL/100μL预处理后的污泥;更优选的， 步骤9)中贮存液Ⅲ的加入量为30μL/100μL预处理后的污泥;
步骤9)所述的DNase I(RNase free)为无RNA酶的脱氧核糖核酸酶I;RNase抑制剂为一种 大肠杆菌表达的重组蛋白，可以通过非竞争性方式按1:1比例和RNase A、RNase B或RNase C 结合，并抑制这三种酶的活性，保护RNA不被这三种酶降解。
优选的，步骤9)中加入DNase I(RNase free)30U和RNase抑制剂40U，并于37℃作用15 min。
其中，所有耗材都要经过DEPC处理及高压灭菌。所述DEPC为焦碳酸二乙酯，是一种强 烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
本文所述的“上清”指上层清液。
DEPC处理水：无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC)，室温搅拌4小时以上， 121度高压灭菌20分钟，冷却备用。
更优选的，技术方案如下：
取10mL活性污泥于15mL的灭菌离心管中离心8000r/min，4℃，5min，弃上清后，向 管内加入3g灭菌玻璃珠(直径2～3mm)和1.4mL贮存液Ⅰ，将离心管管盖拧紧后置于旋涡混合 器击打5min以解絮凝并洗涤污泥除去腐殖酸，离心8000r/min，4℃，5min，弃上清，重复 处理1次后，用磷酸盐缓冲液PBS洗涤污泥1次，沉淀用于细胞裂解。取一定量预处理后的污 泥样品并加入100μL常用贮存液Ⅱ于37℃温育10min后，加入1mL TRIzol，漩涡振荡5min 后，10000r/min离心10min，取上清加入200μL氯仿，漩涡振荡15s后，室温放置2min并于10000 r/min离心10min，取上清并加入等体积异丙醇，-20℃放置20min，10000r/min离心10min， 弃上清，加入75%乙醇洗涤沉淀后，10000r/min离心5min，弃上清并风干沉淀，用30μL常用 贮存液Ⅲ溶解核酸沉淀后，加入DNase I(RNase free)30U和RNase抑制剂40U，并于37℃作用 15min，进一步采用RNA纯化试剂盒纯化RNA。其中，所有耗材都要经过DEPC处理及高压灭 菌。
提取RNA贮存液Ⅰ：Tris-HCl50mmol/L+EDTA20mmol/L+Nacl100mmol/L+PVP1%配 制成100ml溶液;EDTA为乙二胺四乙酸，Tris-HCl为三(羟甲基)氨基甲烷，PVP为聚乙烯 基吡咯烷酮均聚物，简称贮存液Ⅰ。PVP在贮存液Ⅰ的浓度是1%。所述的提取RNA贮存液 中，如无特殊说明，所述浓度均为提取RNA贮存液中的溶质浓度。
提取RNA贮存液Ⅱ：20mg/mL溶菌酶+20mg/mL蛋白酶K+10%SDS配制成100ml溶 液;溶菌酶为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，蛋白酶K为是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶， SDS为十二烷基磺酸钠，简称贮存液Ⅱ。
提取RNA贮存液Ⅲ：1.2mL DEPC处理水+1mmol BSA配制成100ml溶液;DEPC处理水 为无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC)，室温搅拌4小时以上，121度高压灭 菌20分钟，冷却备用。BSA为牛血清白蛋白。简称贮存液Ⅲ。
本发明的有益效果在于：
1、本发明制备的提取液为溶菌酶、蛋白酶K、SDS，利于微生物细胞壁裂解。
2、本发明制备的提取液中含有BSA，可以促进PCR反应的稳定性。
3、本发明制备的提取液配方组成，是实验室普遍采用的常规试剂，经济性好。
4、本发明制备的提取液无毒、无刺激性气味，操作安全。
5、本发明简化了微生物总RNA提取步骤，实现了快速、高效的提取厌氧颗粒污泥的微生 物总RNA。
6、本发明制备的提取液提取效果好，蛋白质、酚类等杂质残留较少。
通过比较RNA产量、纯度、降解程度、特定基因的扩增能力、微生物多样性等评价指标， 考察和探讨RNA提取方法对活性污泥总RNA提取效果的影响并最终建立了一种快速、有效的 活性污泥RNA提取方法。即在TENP和PBS洗涤沉淀污泥的基础上，分别采用溶菌酶和TRIzol 裂解活性污泥细菌、氯仿去除细菌裂解液中的蛋白和大部分DNA、异丙醇沉淀核酸和DNaseI 水解残留DNA后，最后进一步用离心柱纯化RNA。
结果表明，这种方法可以有效提取高质量的菌群RNA，不仅提取的RNA总量多(每g污泥 可提取169.6μgRNA)、纯度高、降解程度低、完整性好、具有丰富的生物多样性，而且可同 时进行16SrRNA和amcrA基因的RT-PCR扩增反应;与其它方法相比，性价比高，具有明显的 优越性，适用于活性污泥RNA的大量提取，同时，T-RFLP结果证明RNA提取方法对分析样品 的微生物种类和丰度分析结果影响较大，不同的RNA提取方法所获得的微生物群落基因多样 性及其种类、丰度均不同。本研究建立了一种快速、有效的高质量RNA提取方法，将在监测 活性污泥菌群动态变化、菌群代谢功能学、微生物群落芯片等研究上具有重要意义。
