申请日2013.07.22
公开(公告)日2014.07.23
IPC分类号C12N1/20; C12N1/14; C12R1/885; C12R1/07; C02F3/34
摘要
本发明涉及一种处理畜禽养殖污水的复合生物菌剂及其制造方法，属于环境生物技术领域。本发明的微生物菌株为解淀粉芽孢杆菌IAE(BacillusamyloliquefaciensIAE)、棘孢木霉12(Trichodermaasperellum12)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)。本发明适用于污水排放量较大的畜禽养殖业的污水处理，能够通过微生物分解、絮凝大颗粒固体物质(包括蛔虫卵等有害生物)、杀灭蚊蝇的有害生物、减少臭气排放等方式处理养殖业污水。处理后的污水固体悬浮颗粒、COD显著降低，污水处理后作为液体有机肥或者清水混合灌溉用水能够有效的降低施用土壤的负载，减少对土壤的污染，有效缓解集约化养殖在一定时空产生高浓度污水导致周围土壤难以消纳的难题。
CCTCC NO：M 2013086 2013.03.15 CCTCC NO：M 2013213 2013.05.16
权利要求书
1.一种畜禽养殖 污水处理复合生物菌剂，其特征为复合生物菌剂含有解淀粉芽孢杆菌IAE(Bacillus amyloliquefaciens IAE)、棘孢木霉12(Trichoderma asperellum 12)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis);
其中所述的一株解淀粉芽孢杆菌IAE(Bacillus amyloliquefaciens IAE)，于2013年3月15日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，保藏编号CCTCC NO：M 2013086，简称为解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086;
所述的一株棘孢木霉12(Trichoderma asperellum 12)，于2013年5月16日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，保藏编号CCTCC NO：M 2013213，简称为棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213。
2.权利要求1所述一种畜禽养殖污水处理复合生物菌剂的制备方法，其特征在于按如下步骤实现：
1)将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086菌株接种到液体种子培养基，培养的条件为：摇床震荡170rpm，培养温度37℃，培养24小时，菌落形成单位≥1×109 cfu ml-1;所用的液体种子培养基配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g，自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min;将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086种子按照5%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28~35℃，溶氧通气量范围为30～100%，150~220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×109 cfu ml-1，发酵液低温储存备用;所用的液体发酵培养基的配方为，按照1L培养基配制：葡萄糖80g，谷氨酸钠50g，(NH4)2SO4 8g，NaCl 5g，K2HPO4·3H2O 2g，MnSO4·7H2O 0.25g，MnSO4?H2O 0.03 g，蒸馏水1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min;
2)棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213接种到PDA培养液中，进行液体种子培养，培养条件为：摇床震荡120rpm，培养温度25℃，培养72小时，菌落形成单位≥0.5×108 cfu ml-1;所用的液体的种子PDA培养基的配方为，按照1L培养基配制：用200 g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min，用纱布过滤后，滤液加20 g普通蔗糖，定容至1000 ml，pH值自然，115℃灭菌30 min;将棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213种子按照10%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH自然，培养温19~22℃，溶氧通气量范围为30～100%，90~170rpm，发酵中后期形成菌丝球用转速250rpm搅拌打碎成菌丝片段，发酵棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213菌株的菌落形成单位≥0.5×108 cfu ml-1，发酵液低温存贮备用;所用液体发酵培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)：用100 g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min，经过滤后滤液中加5g普通蔗糖和2g水稻秸秆粉，定容至1000 ml，pH值自然，115℃灭菌30 min;
3)苏云金芽孢杆菌接种到液体种子培养基，培养条件为：摇床震荡170rpm，培养温度37℃，培养24小时，菌落形成单位≥1×109 cfu ml-1;所用的液体的种子培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g，自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min;将苏云金芽孢杆菌种子按照5%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0~7.5，培养温度25~33℃，溶氧通气量范围为30～100%，150-220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×109 cfu ml-1，发酵液储存备用;所用的液体发酵培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g，自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min;
4)将微生物发酵液菌种按照解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086：棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213：苏云金芽孢杆菌=10：8：1体积比复合，用氢氧化钙调节PH值为8.0~8.5， 后继续搅拌机搅拌0.5~1小时让微生物菌体稳定和进入休眠状态，复合物在常温静置2小时，灌装，即为一种畜禽养殖污水处理复合生物菌剂。
说明书
一种处理畜禽养殖污水的复合生物菌剂及其制造方法
技术领域
本发明涉及处理畜禽养殖污水的复合生物菌剂及其制造方法，属于环境生物技术领域。
背景技术
我国畜禽养殖业发展迅速，在保障城乡畜禽产品供应、促进农民增收、活跃农村经济方面发挥了重要作用。随着畜禽养殖业不断发展，养殖污染物排放量也大幅增加，对区域环境安全构成威胁。根据污染源普查动态更新调查数据，2010年畜禽养殖业的化学需氧量、氨氮排放量分别达到1148万吨、65万吨，占全国排放总量的比例分别为45%、25%，畜禽养殖业主要水污染物排放量中化学需氧量、氨氮排放量分别为当年工业源排放量的3.23倍、2.30倍。
畜禽规模化养殖水平逐步提高，2010年，全国生猪、蛋鸡和奶牛规模养殖比例分别达到65%、79%、47%，猪、牛、家禽年末存栏量分别达到约4.6亿头、1.1亿头、53.5亿只，肉类产量连续22年居世界第一，我国生猪、蛋鸡和奶牛优势省区猪肉、禽蛋和牛奶产量分别占全国总量的92%、68%、88%，海南、天津、北京、新疆、上海、青海、宁夏、西藏等省(区、市)生猪存栏量较低，均不到全国总存栏量的1%。
国内外对于是畜禽养殖业废弃物处理主要依靠土地利用消纳。但是大型的规模化养殖导致在特定时间和空间产生大量的废弃物，废弃物中包括大量的污水，无法长距离运输，废弃物排放量严重超过土地消纳能力，造成农田土壤污染，畜禽粪便中的氮磷等元素、饲料添加剂中的抗生素、激素、铜、铁、铬、锌等物质，长期在土壤中过量累积，导致土壤和地下水环境污染。研究表明，年出栏量10万头的养猪场，污染半径可达5公里，粉尘和气溶胶携带大量包括口蹄疫、猪肺疫、大肠埃希氏菌、炭疽、布氏杆菌、真菌孢子等病原微生物，恶臭、粉尘和微生物排放量远超过大气的自净能力，严重影响空气质量，污染人居环境和人体健康。
减少养殖企业周围土壤的污水消纳负荷，必须要减少污水中有机物的浓度和病原微生物数量，同时处理过程中减少臭气的排出。现有处理养殖污水的方法多为堆肥或者沼气发酵。堆肥方式处理需要大量地添加秸秆、草木灰、锯屑、泥炭等吸水物质，增加处理量和处理成本。沼气处理后，固体物质被厌氧消化成更小的物质，污水总量变化不大，但是沼渣固液分离困难，沼渣后续处理也是一大难题。因此，开发一种方法，使污水处理过程相较于常规方法，臭气、粉尘以及气溶胶量较少，孳生蚊蝇的有害生物量较少，处理后的污水，有机物浓度低，病原微生物数量少，可以直接作为液体有机肥或者清水混灌用水，十分迫切和必要。
三、发明内容
发明的目的在于提供一种处理畜禽养殖业污水的复合生物菌剂，供集约化畜禽养殖污水处理应用。
一种畜禽养殖污水处理复合生物菌剂，其特征为复合生物菌剂含有解淀粉芽孢杆菌IAE(Bacillus amyloliquefaciens IAE)
)、棘孢木霉12(Trichoderma. asperellum 12)和苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis);
其中所述的一株解淀粉芽孢杆菌IAE(Bacillus amyloliquefaciens IAE)，于2013年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，保藏编号CCTCC NO：M 2013086，简称为解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086;
所述的一株棘孢木霉12(Trichoderma. asperellum 12)，于2013年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，保藏编号CCTCC NO：M 2013213，简称为棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213。
上述解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086，其特征在于：用接种环从培养皿中挑取生长24h的该菌接种于装有100ml 絮凝剂合成培养基的250ml三角瓶中，接种量104cfu ml-1，37℃、150rpm培养60h，菌株合成微生物絮凝剂量21.8 g L-1。
上述解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086发酵所用培养液配制方法为，以配制1L培养液为例：葡萄糖80g，谷氨酸钠50g，(NH4)2SO4 8g，NaCl 5g，K2HPO4·3H2O 2g，MnSO4·7H2O 0.25g，MnSO4H2O 0.03 g，蒸馏水1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min。
上述棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213发酵生产方法为：棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213接种到培养液中培养，其培养条件为培养温度25℃、摇床转速120rpm、培养时间72小时，该菌株发酵液纤维素酶活力25.2 U ml-1。
上述所用培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)：用100 g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min，经过滤后滤液中加5g普通蔗糖和2g水稻秸秆粉，定容至1000 ml，pH值自然，115℃灭菌30 min。
用于生物防治蚊蝇的苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis)菌株购自江苏生久农化有限公司，也可以向其他商业公司或者中国科学院微生物所、南京农业大学、河海大学等科研单位购买。菌株对苍蝇和蚊子具有生物防治作用，对于苍蝇杀灭率高于60%，对于蚊子杀灭率达80%，能够有效的抑制污水中蚊蝇的孳生。
上述苏云金芽孢杆菌发酵液杀灭蚊蝇的测定方法为：苏云金芽孢杆菌接种到菌种培养基，进行培养，其条件为：摇床震荡170rpm，培养温度37℃，培养24小时，菌落形成单位≥1×109cfu ml-1，菌液喷雾于养殖苍蝇和蚊子的广口瓶中，测定相较于喷无菌水处理，菌液喷雾处理蚊蝇的死亡率。
上述所用的液体培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g，自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min。
所述畜禽养殖污水处理的复合生物菌剂的制备，包括：1)将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086菌株接种到液体种子培养基，培养的条件为：摇床震荡170rpm，培养温度37℃，培养24小时，菌落形成单位≥1×109cfu ml-1;所用的液体种子培养基配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g，自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min;将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086种子按照5%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28~35℃，溶氧通气量范围为30～100%，150~220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×109cfu ml-1，发酵低温液储存备用;所用的液体发酵培养基的配方为，按照1L培养基配制：葡萄糖80g，谷氨酸钠50g，(NH4)2SO4 8g，NaCl 5g，K2HPO4·3H2O 2g，MnSO4·7H2O 0.25g，MnSO4H2O 0.03 g，蒸馏水1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min。
2)棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213发酵生产，棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213接种到PDA培养液中，进行液体种子培养，培养条件为：摇床震荡120rpm，培养温度25℃，培养72小时，菌落形成单位≥0.5×108cfu ml-1;所用的液体的种子PDA培养基的配方为，按照1L培养基配制：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min，用纱布过滤后，滤液加20 g普通蔗糖，定容至1000 ml，pH值自然，115℃灭菌30 min;将棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213菌种子按照10%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH自然，培养温19~22℃，溶氧通气量范围为30～100%，90~170rpm，发酵中后期形成菌丝球用转速250rpm搅拌打碎成菌丝片段，发酵液棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213菌株的菌落形成单位≥0.5×108cfu ml-1，发酵液低温存贮备用;所用液体发酵培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)：用100 g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min，经过滤后滤液中加5g普通蔗糖和2g水稻秸秆粉，定容至1000 ml，pH值自然，115℃灭菌30 min。
3)苏云金芽孢杆菌发酵液生产，苏云金芽孢杆菌接种到液体种子培养基，培养条件为：摇床震荡170rpm，培养温度37℃，培养24小时，菌落形成单位≥1×108cfu ml-1;所用的液体的种子培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g，自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min;将苏云金芽孢杆菌种子按照5%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0~7.5，培养温度25~33℃，溶氧通气量范围为30～100%，150~220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×109cfu ml-1，发酵液储存备用。所用的液体发酵培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g，自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min。
4)将微生物发酵液菌种按照解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086：棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213：苏云金芽孢杆菌=10：8：1体积比例复合，用氢氧化钙调节PH值为8.0~8.5，用搅拌机搅拌0.5~1小时让微生物菌体稳定和进入休眠状态。复合物在常温静置2小时，灌装，即为养殖业污水净化菌群。
所述处理养殖业污水菌群可用于养殖业污水存放处直接的喷施、混合或者结合工程措施添加，能够有效的降解污水中大分子物质、沉淀悬浮的各种微生物和固体颗粒物质、有效的抑制污水中孳生蚊蝇类有害生物，减少处理过程中臭气、气溶胶、粉尘的产生，使处理后的污水有机物浓度显著降低。
本发明提供一种能够处理养殖业污水的复合生物菌剂及其生产方法，通过对高产生物絮凝剂、高产纤维素酶以及具有高效生物杀灭蚊蝇的微生物高密度发酵，利用发酵液生产稳定复合菌剂，该菌剂处理养殖业污水快速、低成本、低环境污染，处理后污水有机物浓度显著降低，有利于在现代集约化畜禽养殖污水处理中的应用。
