申请日2008.12.26
公开(公告)日2009.05.27
IPC分类号C12Q1/04; C12Q1/68
摘要
一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方法，它涉及一种功能菌群的检测方法。它解决了目前检测水处理系统中功能菌群稳定性的方法存在无法确定微生物的菌种，检测耗时长、耗费高，及检测结果易失真的问题。检测方法：一、提取生物水处理系统中微生物基因组总DNA;二、用16s rDNA V3区通用引物进行PCR扩增;三、PCR产物与水处理系统功能菌群标准样品同步进行DGGE分析。本发明方法能够确定被测微生物的菌种，保证了检测结果的可靠性，其检测结果能更为合理和有效的指导水处理系统工艺，确保水处理系统出水水质。本发明方法检测耗费低，且检测时间短;而且本发明方法检测结果好，条带明亮清晰，不易失真。
权利要求书
1、一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方法，其特征在于功能菌 群在水处理系统中稳定性按以下步骤进行检测：一、提取生物水处理系统中微 生物基因组总DNA;二、用16s rDNA V3区通用引物进行PCR扩增;三、PCR 产物与水处理系统功能菌群标准样品同步进行DGGE分析，即得出检测结果; 其中步骤三中水处理系统功能菌群标准样品按以下步骤获得：a、水处理系统 功能菌培养后分别固定于活性炭上;b、分别提取水处理系统功能菌基因组总 DNA;c、用16s rDNA V3区通用引物进行PCR扩增;d、取每株功能菌PCR 产物100μL混合，然后用核酸共沉剂将DNA沉淀析出，冷冻干燥后-20℃保 存，使用前溶解于100μL TE缓冲溶液或无菌去离子水中，制成样品;e、样品 与全部单一功能菌同步进行DGGE分析，样品条带与单一功能菌条带一一对 应为水处理系统功能菌群标准样品;步骤二中16s rDNA V3区通用上游引物 BSF338的碱基序列为：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，16s rDNA V3 区通用下游引物BSR534的碱基序列为： 5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3’;步骤二 中16s rDNA V3区通用引物PCR反应体系为50μL，其中上游引物的浓度为 0.5μmol/L、下游引物的浓度为0.5μmol/L、dNTP的浓度为200μmol/L、模板 为50ng、10×PCR Buffer缓冲液为12.5μL、Pfu DNA聚合酶为2.5U以及余量 的无菌纯水;步骤二中16s rDNA V3区通用引物PCR反应条件：94℃预变性 5min，然后20个循环的降落PCR，94℃变性30s、退火温度由65℃开始、每 2个循环退火温度降低1℃、退火1min、20个循环后退火温度为55℃、72℃ 延伸1min，之后10个循环94℃变性1min、55℃退火min、72℃延伸1min， 最后72℃延伸5min;步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中 16s rDNA V3区通用上游引物BSF338的碱基序列为： 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，16s rDNA V3区通用下游引物BSR534 的碱基序列为： 5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3’;步骤三 中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNA V3区通用引物PCR 反应体系为50μL，其中上游引物的浓度为0.5μmol/L、下游引物的浓度为 0.5μmol/L、dNTP的浓度为200μmol/L、模板为50ng、10×PCR Buffer缓冲液 为12.5μL、Pfu DNA聚合酶为2.5U以及余量的无菌纯水;步骤三中水处理系 统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNA V3区通用引物PCR反应条件： 94℃预变性5min，然后20个循环的降落PCR，94℃变性30s、退火温度由65 ℃开始、每2个循环退火温度降低1℃、退火1min、20个循环后退火温度为 55℃、72℃延伸1min，之后10个循环94℃变性1min、55℃退火min、72℃ 延伸1min，最后72℃延伸5min。
2、根据权利要求1所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方 法，其特征在于步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤a水处理系 统功能菌培养后分别固定于活性炭上：分别挑选水处理系统功能菌单菌落转入 5mL LB培养基中培养12～16h，然后离心，离心沉淀分别用1mL无菌水重悬， 再将重悬液接种于无菌的活性炭体系中，固定48h;其中活性炭体系由100mL 水和10g活性炭组成。
3、根据权利要求2所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方 法，其特征在于步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤b将5g固 定有功能菌群的活性炭置于三角瓶中加入5mL DNA抽提缓冲液进行超声振 荡，然后加入100μL浓度为50mg/mL的蛋白酶K，在37℃、225r/min的条件 下摇床30min，之后加入3mL质量浓度为10%的SDS裂解液，再置于65℃ 环境中水浴2h，而后将三角瓶中的物质移入50mL离心管在室温、12000r/min 的条件下离心10min，向离心上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇在12000r/min 条件下离心30min，并用体积浓度为75%乙醇清洗离心沉淀，再将离心沉淀溶 解于TE缓冲液，即可得到功能菌群基因组总DNA。
4、根据权利要求3所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方 法，其特征在于步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤b中氯仿/ 异戊醇中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
5、根据权利要求3所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方 法，其特征在于步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤b中DNA 抽提缓冲液中Tris-HCl的浓度为100mmol/L、EDTA的浓度为100mmol/L、磷 酸盐缓冲液的浓度为100mmol/L、NaCl的浓度为1.5mol/L、CTAB的浓度为 1%(质量浓度);DNA抽提缓冲液pH值为8.0。
6、根据权利要求1、2、3、4或5所述的一种功能菌群在水处理系统中稳 定性的检测方法，其特征在于步骤三中DGGE分析中选用浓度为8%的聚丙烯 酰胺凝胶，变性剂高浓度端浓度为60%，变性剂低浓度端浓度为30%;DGGE 分析在150V电压、60℃条件下电泳4h。
7、根据权利要求6所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方 法，其特征在于步骤一将5g功能菌群负载载体置于三角瓶中加入5mL DNA 抽提缓冲液进行超声振荡，然后加入100μL浓度为50mg/mL的蛋白酶K，在 37℃、225r/min的条件下摇床30min，之后加入3mL质量浓度为10%的SDS 裂解液，再置于65℃环境中水浴2h，而后将三角瓶中的物质移入50mL离心 管在室温、12000r/min的条件下离心10min，向离心上清液中加入等体积的氯 仿/异戊醇在12000r/min条件下离心30min，并用体积浓度为75%乙醇清洗离 心沉淀，再将离心沉淀溶解于TE缓冲液，即可得到微生物基因组总DNA。
8、根据权利要求7所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方 法，其特征在于步骤一中氯仿/异戊醇中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
9、根据权利要求7或8所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检 测方法，其特征在于步骤一中DNA抽提缓冲液中Tris-HCl的浓度为 100mmol/L、EDTA的浓度为100mmol/L、磷酸盐缓冲液的浓度为100mmol/L、 NaCl的浓度为1.5mol/L、CTAB的浓度为1%(质量浓度);DNA抽提缓冲液 pH值为8.0。
说明书
一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方法
技术领域
本发明涉及一种功能菌群的检测方法。
背景技术
随着我国经济的高速增长，城市化水平的不断提高，水污染问题日趋严峻。 水处理系统中生物处理以其成本低、效果好、无二次污染成为水污染治理的主 要手段。但是，对于难降解有机化合物而言，传统的生物处理系统中缺乏存在 有效降解微生物，而且传统生物处理方法还存在以下缺陷：1)降解速率慢;2) 降解效果不稳定;3)系统中需较长时间才能产生降解性微生物，启动时间长。
直接投加对目标污染物具有特效降解能力的微生物(即功能菌群)是目前 较为常用的技术手段。功能菌经过筛选、培养、驯化之后投入到水处理系统， 可附着在载体上形成生物膜，也可以以游离状态存在。功能菌群以目标污染物 为唯一碳源和能源，具有反应系统启动期短、处理效果稳定、降解速度快、处 理效果好等优点。在生物水处理系统中科研人员希望功能菌群成为优势菌种， 但是功能菌群易受外界环境中物理、化学、营养组成以及其他微生物的影响。
水处理系统中污水(外界环境)发生变化会导致功能菌群优势降低甚至丧 失，致使水处理系统不稳定，影响出水水质。因此，对水处理系统中功能菌群 的稳定性进行跟踪监测，可指导水处理系统工艺的优化和调整，以保证功能菌 群的稳定。
目前，对水处理系统中功能菌群稳定性监测均是采用提取水处理系统中细 菌的总DNA，经PCR扩增后应用于变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析菌群结构。 虽然这种方法能分析水处理系统中的菌群结构，却不能确定菌群的具体种属。 由于随着水处理系统的运行功能菌群可能发生群落演替，而替代功能菌的新优 势菌可能与原功能菌属于同一菌种;因此这种方法的检测结果并不可靠。
目前还有人提出将PCR-DGGE测定后的特异性条带回收后测序，通过 BLAST比对后确定水处理系统中微生物的种属，但是此方法具有以下缺点：
第一、只能确定菌属仍然无法确定到种，因此对于功能菌群为同属不同种 或着替代优势菌与功能菌同属情况，难以起到监测的作用;
第二、回收后的条带通常需经过TA克隆后才能进行测序，因此耗时长， 且耗费高;
第三、检测结果容易出现失真现象，导致鉴定结果与实际不符。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前检测水处理系统中功能菌群稳定性的方法 存在无法确定微生物的菌种，检测耗时长、耗费高，及检测结果易失真的问题， 而提供了一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方法。
功能菌群在水处理系统中稳定性按以下步骤进行检测：一、提取生物水处 理系统中微生物基因组总DNA;二、用16s rDNA V3区通用引物进行PCR扩 增;三、PCR产物与水处理系统功能菌群标准样品同步进行DGGE分析，即 得出检测结果;其中步骤三中水处理系统功能菌群标准样品按以下步骤获得： a、水处理系统功能菌培养后分别固定于活性炭上;b、分别提取水处理系统功 能菌基因组总DNA;c、用16s rDNA V3区通用引物进行PCR扩增;d、取每 株功能菌PCR产物100μL混合，然后用核酸共沉剂将DNA沉淀析出，冷冻 干燥后-20℃保存，使用前溶解于100μL TE缓冲溶液或无菌去离子水中，制成 样品;e、样品与全部单一功能菌同步进行DGGE分析，样品条带与单一功能 菌条带一一对应为水处理系统功能菌群标准样品;步骤二中16s rDNA V3区通 用上游引物BSF338的碱基序列为：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，16s rDNA V3区通用下游引物BSR534的碱基序列为： 5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3’;步骤二 中16s rDNA V3区通用引物PCR反应体系为50μL，其中上游引物的浓度为 0.5μmol/L、下游引物的浓度为0.5μmol/L、dNTP的浓度为200μmol/L、模板 为50ng、10×PCR Buffer缓冲液为12.5μL、Pfu DNA聚合酶为2.5U以及余量 的无菌纯水;步骤二中16s rDNA V3区通用引物PCR反应条件：94℃预变性 5min，然后20个循环的降落PCR，94℃变性30s、退火温度由65℃开始、每 2个循环退火温度降低1℃、退火1min、20个循环后退火温度为55℃、72℃ 延伸1min，之后10个循环94℃变性1min、55℃退火min、72℃延伸1min， 最后72℃延伸5min;步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中 16s rDNA V3区通用上游引物BSF338的碱基序列为： 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，16s rDNA V3区通用下游引物BSR534 的碱基序列为： 5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3’;步骤三 中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNA V3区通用引物PCR 反应体系为50μL，其中上游引物的浓度为0.5μmol/L、下游引物的浓度为 0.5μmol/L、dNTP的浓度为200μmol/L、模板为50ng、10×PCR Buffer缓冲液 为12.5μL、Pfu DNA聚合酶为2.5U以及余量的无菌纯水;步骤三中水处理系 统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNA V3区通用引物PCR反应条件： 94℃预变性5min，然后20个循环的降落PCR，94℃变性30s、退火温度由65 ℃开始、每2个循环退火温度降低1℃、退火1min、20个循环后退火温度为 55℃、72℃延伸1min，之后10个循环94℃变性1min、55℃退火min、72℃ 延伸1min，最后72℃延伸5min。
本发明方法能够确定被测微生物的菌种，保证了检测结果的可靠性，其检 测结果能更为合理和有效的指导水处理系统工艺，确保水处理系统出水水质。 本发明方法检测耗费低，且检测时间短，省去了条带回收及BLAST比对的时 间。而且，本发明方法检测结果好，条带明亮清晰，不易失真。
