申请日2007.05.21
公开(公告)日2008.03.05
IPC分类号C12N1/20; C02F3/34; C12R1/22; C02F3/12; C12Q1/68; C02F1/62
摘要
本发明针对生物膜处理低浓度含铅废水中微生物所存在的耐受性和吸附性能问题，公开了一种优势菌，菌种名称为：肺炎克雷伯氏klebsiella pneumoniae CGMCC No.2016，简称Z-KAE15。特征之一是该菌尚未发现的对铅的高耐受性，高吸附性及工业实用性。Z-KAE15单菌育膜及混合育膜对污水中铅和COD的去除率分别高达95%、90%以上。所处理的污水铅初始浓度为120mg/L以下，COD初始浓度为100-1200mg/L;应用条件pH：5.5-8.5，温度：10℃-40℃，菌膜载体为聚乙烯或聚丙烯多孔环片。特征之二是该菌的获取方法，通过对自然水体生物膜的驯化、纯化、分离和反复筛选后，经16s rDNA测序证实。本发明的优势菌应用于环境生物工程领域，将成为拓展的生物膜法，使之在水处理工程中对含铅和低浓度铅物系污水的处理工艺简单连续。
权利要求书
1.本发明公开了一种新的优势菌，名称为肺炎克雷伯氏菌klebsiella pneumoniae CGMCC2016，简称为Z-KAE15，其特征是该菌与克雷伯氏菌属(Klebsiella)同源，并在相应菌 属中尚未发现具有对铅高耐受性、高吸附性和工业实用性的特性。
2.如权利要求1所述Z-KAE15具有的对铅高耐受性：在铅含量达300umol/L时菌体生 长率仍稳定在760%以上;高吸附性特性、工业实用性特征：通过Z-KAE15单菌育膜和混合育 膜去除污水中的铅和COD，去除率分别可达95%、90%以上;应用条件：污水中铅初始浓度 为30-120mg/L，初始COD为100-1200mg/L，温度为10-40℃，pH为5.5-8.5。
3.如权利要求1所述的Z-KAE15的获取及鉴定方法：采取污水厂二沉池活性污泥在自 然水体中培养生物膜，育膜用的材料是聚乙烯或聚丙烯制成的多孔环，用递增含铅量法对生 物膜菌群驯化后，通过稀释倍数法和琼脂划线法纯化，对纯化后的单菌株逐一在一定浓度的 含铅废水中作吸附比较、筛选，得到对铅具有高耐受性、高吸附性的优势菌，通过PCR扩增， 16S rDNA的测序，并与相应的NCBI数据库对比，确定为肺炎克雷伯氏菌。
4.如权利要求1、3所述菌种Z-KAE15的筛选所用培养基分别为牛肉膏蛋白胨、淀粉琼 脂、查氏和GGY培养基等。
说明书
一种优势菌及用于含铅废水的处理
技术领域
本发明属于环境生物工程技术领域，具体涉及到一种对铅具有高耐受性和高吸附性的优 势菌，名称为肺炎克雷伯氏菌klebsiella pneumoniae。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物 研究所。保藏中心登记入册编号：2016，保藏日期：2007-04-23，简称Z-KAE15，是利用自 然水体生物膜，经驯化、筛选、纯化、分离所得。该菌可用于含铅废水及含铅物系的处理。
背景技术
铅主要通过大气沉降、土壤沥出液以及地表径流等进入天然水体，其来源主要为采矿 冶金、电镀、燃煤、陶瓷和玻璃制造等工业活动，以及含铅汽油、含铅油漆、涂料和含铅水 管的使用等。铅的毒性具有长期性和持久性，对其治理已引起了国际社会的高度重视和广泛 关注，更是环境工作者们义不容辞的任务。目前，处理含铅废水的技术方法多种多样，大体 可归纳为物理法、化学法、物理化学法、生物法和高效集成法等。然而处理低浓度的含铅废 水时，往往操作费用和原材料成本过高，经济损失太大，到目前还没有找到一种更为经济、 有效、实用、方便的方法。微生物法处理含铅废水已经有所研发，其中以微生物培养生物膜 来处理金属废水备受关注。生物膜法的主要优点有：产生的污泥量较少;抗冲击负荷的能力 较强;运行管理较方便、动力消耗较少。Alexis S.Templeton等考察过附着在α-Al2O3单晶体上 的Burkholderia cepacia生物膜对pb2+的生物矿化和吸附(1.Alexis S，Templeton Thomas P，Trainor，Alfred M，Spormann，Mathew Newville，Steven R，Sutton，Alice，Dohnalkova，Yuri Gorby，Gordon E，Brown，J R.Sorption versus Biomineralization of Pb(II)within Burkholderia cepacia Biofilms.Environ.Sci.Technol.2003，37，300-307.)。董德明等对自然水体生物膜吸附金 属离子进行了大量的研究(2.董德明，纪亮，花修艺，李鱼，郑娜.自然水体生物膜吸附Co， Ni和Cu的特征研究.高等学校化学学报.2004，25(2)：247-251)。Wei-Bin Lu等运用Enterobacter sp.J1吸附铅离子，最大吸附量达到50mg/g(3.Wei-Bin Lu，Jun-Ji Shi，Ching-Hsiung Wangc， Jo-Shu Chang，Biosorption of lead，copper and cadmium by an indigenous isolate Enterobacter sp. J1possessing high heavy-metal resistance.Journal of Hazardous Materials B134(2006)80-86.)。但 是由于重金属对微生物的毒害作用，使得生物膜法的应用受到了限制。本发明筛选出的优势 菌种其在铅存在条件下不仅存活很好，还可在降低废水中铅浓度的同时降低COD的浓度。解 决了微生物的耐受性问题，使生物膜法处理废水有了新的突破。
发明内容
本发明针对生物膜处理低浓度含铅废水中微生物所存在的耐受性和吸附性能问题，利用 自然水体生物膜培养、驯化、纯化、分离出嗜铅优势菌，其名称为：肺炎克雷伯氏菌klebsiella pneumoniae。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址： 北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所。保藏中心登记入册编号：2016， 保藏日期：2007-04-23，简称Z-KAE15。该菌与克雷伯氏菌属(Klebsiella)同源，同源性达99.9 %;特征是该菌尚未发现的具有对铅的高耐受性和高吸附性特点。其可在铅的浓度超过饮用 水标准2460倍以上存活很好，最大吸附量可达208mg/g。本发明提出了利用嗜铅优势菌培养 生物膜来吸附降解废水中低浓度铅的方法，这种方法同时也可去除废水中的COD，解决了生 物膜法处理废水中菌群在逆境条件下的耐受性和持续吸附性问题，具有广阔的工业实用性。
解决生物膜法处理废水中菌群的耐受性和持续吸附性的问题，具体方案如下：
1.混合生物膜的培养：在自来水中加入培养生物膜所必需的氮源，磷源等营养元素和活 性污泥，模拟天然水体育膜。
2.吸附铅的优势菌种的驯化、纯化和筛选：取一定体积的生物膜菌悬液分别于含铅量递 增的培养基中驯化。将其在铅极限浓度下的存活菌运用稀释倍数法和琼脂划线法纯化。将纯 化后的若干单菌株用于吸附铅浓度递增的废水，通过原子吸收法测定其吸附能力，得到对铅 具有高吸附能力的优势菌。
3.菌属的确定：对优势菌株通过作生理生化实验及16S rDNA同源性分析的方法确定其 菌种。
(1)嗜铅优势菌的形态确定：经鉴定Z-KAE15菌株菌落形态较大、白色、边缘整齐光 滑;菌体染色后呈革兰氏阴性，直杆菌，宽0.3-1.0tm，长0.6-6.0μm，单个、成对或短链状 排列;兼性厌氧，有荚膜。菌落形态附图1和革兰氏染色附图2。
(2)嗜铅优势菌种的生理生化试验：
①过氧化氢酶测定 几乎没有气泡。
②葡萄糖和葡萄糖酸盐 产酸产酸产气。
③淀粉水解 不水解
④硫化氢 产硫化氢
⑤明胶液化 不能水解
⑥甲基红生理生化试验 显红色。
(3)嗜铅菌株的PCR扩增和16S rDNA测序：
①在培养基中挑取细菌于10μl灭菌水中，99℃变性后离心取上清作为模板，使 用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.D310)，以Forward /Reverse primer2为引物，扩增目的片段。取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，结果附图3。
②使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶 回收目的片段，取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，结果附图4。
③以Seq Forward、Seq Reverse、Seq Internal为引物对上述回收产物进行DNA测序。
DNA序列附后。
④与NCBI数据库中具有同源性的16S rDNA序列进行对比，结果附后。
4.嗜铅优势菌对含铅废水处理的优势
与现在国内外使用其它方法处理含铅废水相比(4.Yarrow M，Nelson，Leonard W.Lion Modeling Oligotrophic Biofilm Formation and Lead Adsorption to Biofilm Components.Environ Sci.Technol.1996，30，2027-2035;5.刘月英李仁忠张秀丽等固定化地衣芽孢杆菌R08 吸附pd2+的研究微生物学报2002Vol.42No.6P.700-705)，本发明将微生物降解技术和生物 吸附技术相结合，提出用嗜铅优势菌为主体培养生物膜处理含铅废水的方法，具有菌群存活 的更大优势和可持续性。本发明的优势菌对铅离子具有高选择性、高耐受性和高吸附性。
具体实施方式
实施例1：用本发明方法处理大连经济技术开发区水质净化厂的废水。其过程如下：
1.生物膜的培养：
选择大连经济技术开发区某水质净化厂二沉池的活性污泥用自来水清洗后，将一定量清 洗过的污泥倒入人工废水中，用聚乙烯或聚丙烯多孔环载生物膜，并调节水温为10-40℃，进 行间歇有氧培养，培养成膜时间为5-25天。
2.嗜铅优势菌种的驯化、纯化和筛选：
驯化：在培养的生物膜上取一定量的菌液，配置成一定浓度的菌悬液。分别置于牛肉膏 蛋白胨培养基、淀粉琼脂培养基、查氏培养基、CGY培养基中进行培养，逐渐调整每种培养 基中铅离子浓度为0-300umol/L。在10-40℃恒温振荡环境下培养8-80h。用原子吸收法确定 不同铅离子浓度下菌群的生长情况。
纯化：驯化好的菌分别采用常规稀释法和平板纯培养法纯化。每个培养基提纯若干个单 菌株。
筛选：将纯化后的若干单菌株对铅离子吸附，并作吸附量的比较，具体步骤如下：
分别配制一定浓度的单菌株菌悬液，置于铅离子浓度不同的锥形瓶中，在一定的离子强 度下，调节pH值为5.5-8.5，于恒温摇床中(10℃-40℃，8-80h)振荡培养，使菌体充分 吸附铅离子。吸附处理后的菌体经离心分离，其残余的铅离子浓度用原子吸收仪测定。比较 各单菌株的吸附能力，筛选出对铅离子吸附的优势菌。
3.菌株菌属的确定：
本发明做了生理生化实验，Z-KAE15菌株菌落形态较大、白色、边缘整齐光滑。菌体染 色后呈革兰氏阴性，直杆菌，宽0.3-1.0μm，长0.6-6.0μm。单个、成对或短链状排列。兼性 厌氧有荚膜。菌落形态附图1和革兰氏染色附图2。
在生理生化试验的基础上采用PCR扩增，16S rDNA测序进行鉴定方法如下：
①使用TaKaRa16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit，以Forward primer/Reverse- primer2为引物，扩增目的片段后，取一定量进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增效果;目 视观察，PCR片段扩增量满足后续实验的要求(>10μg)，附图3。
②使用TaKaRaAgarose Gel DNAPurification Kit Cer.2.0切胶回收目的片段，取一定 量进行琼脂糖凝胶电泳，确认回收效果;目视观察切胶回收目的片段满足测序要求 (>5μg)，附图4。
③将上述经凝胶电泳收集的目的片段，通过测序反应测定出该菌株的16S rDNA的 序列，附后。
④将Z-KAE15菌株16S rDNA的序列与NCBI数据库中具有同源性的16S rDNA序 列进行对比(Blast)，对比结果附后，确定测定优势菌株的种属。其结果如下：
根据已命名的菌株初步断定Z-KAE15为肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)。 Z-KAE15菌株是经过铅存在极限条件下驯化而得到的，在其功能上具备了对铅的高耐受性和 高吸附性的特点。
4.用所发明的优势菌处理大连经济技术开发区某水质净化厂的废水。
采用优势菌株育膜、混合育膜和未驯化生物膜与包埋法对比处理含铅废水。育膜条件、 吸附条件和吸附结果测定方法同上。
附图5为COD去除效果比较图，附图6为铅的去除率比较图。由图5、6所示，育膜法 处理废水的效果好于包埋法，且优势菌的处理效果比未驯化的生物膜菌群的处理效果可提高 30%，高达95%以上。且有高耐受性和高吸附性，此菌能够在含铅高达300mg/L时仍能存活， 最大吸附量高达208mg/g。
关于培养条件：四种培养基分别为牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉琼脂培养基、查氏培养基、 CGY培养基。培养条件：温度控制在10-40℃，pH控制在5.5-8.5，在恒温振荡器下培养8 -80h。筛选过程中吸附的含铅废水中用1M的NaNO3调节离子强度至0.1M。
