申请日2018.01.27
公开(公告)日2018.07.24
IPC分类号C02F3/34; C02F103/34
摘要
本发明属于废水生物强化处理领域，具体涉及一种提高低温环境下清洗剂废水微生物处理效果的激活促进剂。光伏产业清洗剂废水具有高COD、高pH值等特点，使用常规生物处理方法难以达标排放，若废水处于低温环境下，则生物降解效果更不理想。本发明使用丙酮酸钠、柠檬酸、硝酸钾、脯氨酸、硫酸锰和硫酸亚铁，提供了一种微生物激活促进剂，可有效改善微生物在低温、高COD、高pH下的生长繁殖能力，促进微生物的代谢活性，有效提高污水处理效果。本发明成本低廉、制作方便，可实际应用于光伏产业及其他行业产生的清洗剂废水生物处理过程。
权利要求书
1.一种微生物激活促进剂，其特征在于：以1L水为溶剂，组分包括：丙酮酸钠5～25g、柠檬酸25～160g、硝酸钾30～90g、脯氨酸5～40g、硫酸锰20～100g、硫酸亚铁50～80g;所述柠檬酸的质量是脯氨酸质量的4～5倍。
2.根据权利要求1所述的一种微生物激活促进剂，其特征在于：所述的硫酸锰含量为40～100g。
3.根据权利要求1所述的一种微生物激活促进剂，其特征在于：所述的丙酮酸钠8～12g、柠檬酸100～130g，硝酸钾35～45g，脯氨酸15～25g。
4.权利要求1或2或3所述的微生物激活促进剂，在清洗剂废水处理中的应用。
5.根据权利要求4所述微生物激活促进剂在清洗剂废水处理中的应用，其特征在于：具体步骤包括：
(1)向待处理废水中接种复合微生物菌剂，接种量为10%、OD600=0.1～0.2，;
(2)在步骤(1)已接种复合微生物菌剂的废水中添加微生物激活促进剂，添加比例为每千升污水添加一升微生物激活促进剂，工作温度为：8～30℃。
6.权利要求5所述复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)废水准备：将SDS和Brij35以质量比为1:1的比例充分溶解于水中，获得初始浓度为1500mg COD/L的废水;
(2)将Pseudomonas sp.SDS-N2菌液和Pseudomonas pseudoalcaligenes sp.PG-1菌液按体积比为1:1接种入步骤(1)所述废水，混合培养，混菌总接种量为20%;
(3)以质量比，COD:N:P=200:5:1的比例，添加N、P入步骤(2)所述已接种混菌的废水中，再添加微量元素5mL/L，在温度为28℃、pH=8.0±0.5且溶氧充足的环境下，连续培养24h，即得复合微生物菌剂。
7.根据权利要求6所述复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述微量元素的制备方法为：以1L水为溶剂，充分溶解：EDTA 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 0.22g/L，CaCl20.055g/L，MnCl2·4H2O 0.051g/L，FeSO4·7H2O 0.049g/L，(NH4)2Mo7O24·4H2O 0.011g/L，CuSO4·5H2O 0.0157g/L，CoCl2·6H2O 0.016g/L，使用KOH调节pH=6.0。
8.权利要求5或6或7所述的复合微生物菌剂在清洗剂废水中的应用。
说明书
一种提高清洗剂废水低温微生物处理效果的激活促进剂
技术领域
本发明属于废水生物强化处理领域，具体涉及一种提高清洗剂废水低温微生物处理效果的激活促进剂。
背景技术
光伏产业清洗剂废水，是指光伏产业太阳能光伏硅片清洗过程中产生的废水，其主要成本为阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)和非离子表面活性剂烷基聚氧乙烯醚(平平加类，即天然脂肪醇与环氧乙烷加成物);具有高COD、高pH值等特点。若该类废水排放至环境中，会对生态环境造成很大的隐患。目前，生物法是此类废水处理过程中应用最为广泛的一种方法。然而，微生物在处理清洗剂废水过程中，易受废水的高起泡性和低氧化电位等的毒害，导致生化处理系统不能稳定运行。同时，“光伏产业清洗剂废水低温生物处理研究”等报道指出，我国北方地区、高原乃至高山地区，秋冬季的低温环境对微生物的活性产生明显抑制作用，导致生化处理系统出水水质恶化、难以稳定达标。
低温主要对微生物细胞活性造成影响，如温度降低会造成细胞内酶活性降低、膜流动性降低、RNA结构趋于稳定，从而导致微生物的整体生理机能下降、活性减弱。为提高低温条件下的废水处理效果，目前已被报道的技术方法包括耐低温菌(群)的富集、筛选及固定化(如：CN 1288236 C;CN 107502548 A;CN 107380796 A)、低温处理装置及设备 (如：CN206408040 U;CN 107324618 A)，以及工艺运行参数的调整等。耐低温菌的筛选与应用虽然能强化污染物的去除，但是此类菌存在生长速率较慢，且易被废水处理系统中的土著微生物竞争所淘汰等问题;低温处理工艺及设备在运用过程中存在成本高且对大量低温废水的处理无法适应等问题，而工艺及运行参数的调整则存在调控时间长、难以确保工艺的稳定运行等问题。
目前有较多生物促进剂见诸报道，如：CN 105152357 A一种医药中间体废水生物处理促进剂及其制备方法与应用;CN 104925934 B一种焦化废水生物处理促进剂;CN105036353 A一种印染废水生物处理促进剂及其制备方法，但尚未有关于清洗剂废水生物处理相关的激活促进剂见诸报道。此外，这些促进剂关注的是通过提高微生物的耐毒性和共代谢活性来促进废水处理，很少有专门针对低温下废水处理的激活促进剂的报道，而结合微生物的生长和代谢活性去考察微生物对废水的处理效果的报道则更少。
因此，提出一种提高微生物在较低温度的表面活性剂废水中生存能力的激活促进剂，可显著提高处理效率，降低废水处理成本，且对环境友好，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高清洗剂废水低温微生物处理效果的激活促进剂。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种微生物激活促进剂，以1L水为溶剂，组分包括：丙酮酸钠5～25g、柠檬酸25～ 160g、硝酸钾30～90g、脯氨酸5～40g、硫酸锰20～100g、硫酸亚铁 50～80g;所述柠檬酸的质量是脯氨酸质量的4～5倍。
优选的，所述的硫酸锰含量为40～100g。
优选的，所述的丙酮酸钠8～12g，柠檬酸100～130g，硝酸钾35～ 45g，脯氨酸15～25g。
相应的，所述的微生物激活促进剂，在清洗剂废水处理中的应用。
优选的，所述微生物激活促进剂的在清洗剂废水处理中的应用，具体步骤包括：
(1)按接种量为10%(OD600=0.1～0.2)，往待处理废水中接种复合微生物菌剂;
(2)在已接种复合微生物菌剂的废水中添加微生物激活促进剂，每千升废水中微生物激活促进剂的添加量为一升，工作温度为：8～ 30℃。
相应的，所述复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)废水样本制备：将SDS和Brij35以质量比1:1的比例添加，充分溶解于水中，获得初始浓度为1500mg COD/L的废水;
(2)将Pseudomonas sp.SDS-N2菌液和Pseudomonas pseudoalcaligenes sp.PG-1菌液按体积比为1:1接种并混合培养，混菌总接种量为20%;
(3)按质量比，COD:N:P=200:5:1的比例添加N、P入步骤(1)所述废水中，再添加微量元素5mL/L，在温度为28℃、pH=8.0±0.5且溶氧充足的环境下，连续培养24h，即得复合微生物菌剂。
优选的，所述微量元素制备方法为：以1L水为溶剂，充分溶解： EDTA 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 0.22g/L，CaCl2 0.055g/L，MnCl2·4H2O 0.051g/L，FeSO4·7H2O 0.049g/L，(NH4)2Mo7O24·4H2O 0.011g/L， CuSO4·5H2O 0.0157g/L，CoCl2·6H2O 0.016g/L，使用KOH调节pH=6.0。
相应的，所述的复合微生物菌剂在清洗剂废水中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明针对废水处理过程中低温条件下处理效果不佳、降解速率慢等问题，提供一种适用于低温条件下清洗剂废水(主要包括阴离子和非离子表面活性剂)生物处理的微生物激活促进剂的制备及其应用方法，可显著提高低温环境下清洗剂废水微生物处理能力。
2、本发明从多方面综合促进了微生物的活性。其中：脯氨酸可调节低温环境中微生物细胞的渗透压，维持微生物细胞的稳定性和流动性，能非特异性的保护生物大分子和生物体，提高微生物的耐低温能力;柠檬酸、丙酮酸钠作为有机物，可为微生物生长提供能源物质;锰离子、亚铁离子是多种酶的活性中心位点，适当添加可促进酶活性，进而提高微生物的代谢活性;硝酸盐一方面可微生物提供氮源，另一方面可作为外源电子受体，能加速还原型辅酶Ⅰ(NADH)的氧化，维持细胞处于最佳氧化还原(NADH/NAD+)比率。本发明添加氨基酸和有机物，可促进微生物的低温抗性和生长;添加的硝酸盐、锰离子和亚铁离子能有效促进微生物的酶活性。
3、使用本发明方案制备的微生物激活促进剂，添加的多种物质间发生了未知的联合作用。
(1)柠檬酸用量为脯氨酸用量的15倍及以上时，它们可能发生抗氧化、促生长和维持微生物的渗透压的联合作用，本发明的柠檬酸用量仅为脯氨酸的5倍，微生物生长却达到了与常规用量相当甚至略好的效果，这可能是因为本发明添加的多种物质间发生了未知的联合作用。
(2)硫酸锰可构成微生物的酶活性中心，促进酶活性，但一般添加浓度为10～40mg/L时才有这样的效果(如铁锰离子对生物膜及其胞外聚合物的作用规律研究)，但本发明的硫酸锰用量>40mg/L，微生物生长却达到了与常规用量相当甚至略好的效果，这可能是因为本发明添加的多种物质间发生了未知的联合作用。
(3)亚铁离子可促进微生物的酶活性，但一般使用浓度为5～45 mg/L时效果较好(如：“亚铁对水平潜流人工湿地反硝化作用的影响”;“Effects of Fe2+concentration onbiomass accumulation and energy metabolism in photosynthetic bacteriawastewater treatment”)，但本发明的亚铁离子用量为60～100mg/L，明显高于常规用量，微生物生长却达到了与常规用量相当甚至略好的效果，这可能是因为本发明添加的多种物质间发生了未知的联合作用。
4、本发明获得的微生物激活促进剂，通过调控低温环境下微生物的生长(以蛋白浓度表示)和代谢活性(以电子传递体系ETS表示)来提高污染物的降解，从而更具针对性。
5、经试验证明，本发明的微生物激活促进剂可有效促进低温下微生物的生长和代谢活性，提高污染物去除效率，经济效益明显。同时，该微生物激活促进剂，制备简单，成本低廉，使用方便。
具体实施方式
1、废水样本制备：
将SDS和Brij35以1:1(w/w，质量比)的比例添加，充分溶解于水中，获得初始浓度为1500mg COD/L的光伏产业清洗剂废水，作为全文待处理废水样本。
2、复合微生物菌剂制备：
(1)SDS降解菌来自四川省德阳市的污泥筛选，采用平板划线法。具体步骤为：
1)取污泥20mL，置于含1g/L SDS的液体培养基中进行驯化培养。
所述液体培养基为：Na2HPO4·12H2O 1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，(NH4)SO4 0.3g/L，微量元素5mL/L，SDS 1.0g/L,pH=8.0;
所述微量元素为：以1L水为溶剂，组分包括：EDTA 0.5g/L， ZnSO4·7H2O 0.22g/L，CaCl2 0.055g/L，MnCl2·4H2O 0.051g/L， FeSO4·7H2O 0.049g/L，(NH4)2Mo7O24·4H2O0.011g/L，CuSO4·5H2O 0.0157g/L，CoCl2·6H2O 0.016g/L，pH=6.0(KOH)。
2)当污泥样品对SDS去除率在24h内超过90%时，取1mL样品，用蒸馏水进行梯度稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)，分别各取0.2mL稀释液涂布于1g/L SDS固体培养基中，置于培养箱中在30℃恒温条件下培养24～72h，培养至长出肉眼可见的菌落;
所述SDS固体培养基制备方法为：在步骤1)所述液体培养基中添加0.2%的琼脂粉。
3)挑取长势较快的单菌落于1g/LSDS固体培养基中，并通过划线分离法对菌落进行纯化操作，如此反复操作3～4次，以保证得到纯种菌株。挑取单菌落，将菌株接种到SDS固体培养基中，置于4℃冰箱保藏。
(2)Birj35降解菌来自四川省德阳市的污泥筛选，采用平板划线法。具体步骤为：
1)取污泥20mL，置于含0.5g/L Birj35的液体培养基中进行驯化培养。
所述液体培养基为：Na2HPO4·12H2O 1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，(NH4)SO4 0.3g/L，微量元素5ml/L，Brij35 0.5g/L,pH=8.0;
所述微量元素为：以1L水为溶剂，组分包括：EDTA 0.5g/L， ZnSO4·7H2O 0.22g/L，CaCl2 0.055g/L，MnCl2·4H2O 0.051g/L， FeSO4·7H2O 0.049g/L，(NH4)2Mo7O24·4H2O0.011g/L，CuSO4·5H2O 0.0157g/L，CoCl2·6H2O 0.016g/L，pH=6.0(KOH)。
2)当污泥样品对Birj35去除率在24h内超过90%时，取1mL样品用蒸馏水进行梯度稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)，分别各取0.2mL稀释液涂布于0.5g/L Birj35固体培养基中，置于培养箱中在30℃恒温条件下培养24～72h，培养至长出肉眼可见的菌落。
所述Birj35固体培养基制备方法为：在步骤1)所述液体培养基中添加0.2%的琼脂粉。
3)挑取长势较快的单菌落于0.5g/L Birj35固体培养基中，并通过划线分离法对菌落进行纯化操作，如此反复操作3～4次，以保证得到纯种菌株。挑取单菌落，将菌株接种到Birj35固体培养基中，置于4℃冰箱保藏。
(2)挑一株保存于4℃SDS固体培养基的Pseudomonas sp.SDS-N2 菌株(GenbankNo.MF457589，DNA序列如SEQ ID NO 1所示)，置于含 1000mg/L SDS的已灭菌的LB培养基中，于28℃下恒温培养12h，菌液 OD值达1.0～1.5。
(3)挑一株保存于4℃Birj35固体培养基斜面的Pseudomonas pseudoalcaligenessp.PG-1菌株(Genbank No.MG255175，DNA序列如SEQ ID NO 2所示)，置于含500mg/LBrij35的已灭菌的LB培养基中，于28℃下恒温培养12h，菌液OD值达到0.6～1.0。
(4)将上述Pseudomonas sp.SDS-N2菌液和Pseudomonas pseudoalcaligenessp.PG-1菌液按1:1(v/v，体积比)的比例接种并混合培养，混菌总接种量为20%，将SDS:Brij35按质量比1:1添加(终浓度为1500mg COD/L左右)，添加足量氮磷元素(质量比， COD:N:P=200:20:1)以及微量元素5ml/L，培养温度为28℃，pH为 8.0±0.5，溶解氧充足，连续培养24h，即得复合微生物菌剂。
(5)所述微量元素的制备方法为：以1L水为溶剂，组分包括：EDTA 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 0.22g/L，CaCl2 0.055g/L，MnCl2·4H2O 0.051g/L， FeSO4·7H2O 0.049g/L，(NH4)2Mo7O24·4H2O 0.011g/L，CuSO4·5H2O 0.0157g/L，CoCl2·6H2O 0.016g/L，pH=6.0(KOH)。
3、测定方法
(1)化学需氧量(COD)的测定
COD的测定采用《水质化学需氧量的测定-重铬酸盐法》(GB 11914-89)。具体步骤如下：
1)取20.00mL混合均匀的水样(或适量水样稀释至20.00mL)置于250mL磨口的回流锥形瓶中,准确加入10.00mL重铬酸钾标准溶液及数颗防暴沸玻璃珠，连接磨口回流冷凝管，从冷凝管上端缓慢加入30 mL硫酸-硫酸银溶液，不断旋动锥形瓶使之混匀。自溶液开始沸腾起加热回流2h。
2)冷却后，用20～30mL水冲洗冷凝管壁，取下锥形瓶。溶液总体积不得少于140mL。
3)溶液冷却至室温后，加3滴试亚铁灵指示液，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点，记录硫酸亚铁铵标准溶液的用量。
4)测定水样的同时，取20.00mL重蒸馏水，按同样操作空白实验。记录滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液的用量。
计算公式：
式中，c—硫酸亚铁铵标准溶液的浓度(mol/L);
V1—滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液的耗量(mL);
V2—滴定水样时硫酸亚铁铵标准溶液的耗量(mL);
V—水样体积(mL);
8—氧(1/2O2)摩尔质量(g/mol)。
(2)蛋白质含量测定
蛋白含量测定采用碧云天(Beyotime)公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒检测，蛋白浓度检测仪器为多功能酶标仪(EnVision，美国 PerkinElmer公司)。具体检测步骤为：
1)先将试剂A(试剂盒中自带试剂，产品编号：P0012-1)摇晃混匀，根据样品数量，按50体积试剂A加1体积试剂B(试剂盒中自带试剂，产品编号：P0012-2)试剂配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液在24小时内稳定。
2)稀释标准品：完全溶解蛋白质标准品(5mg/mL BSA，-20℃保存) 取10微升用PBS稀释至100μL(用PBS稀释)，使终浓度为0.5mg/mL。
将稀释后的标准品(0.5mg/mL)按0μL，2μL，4μL，6μL，8μL， 12μL，16μL，20μL分別加到96孔板的蛋白标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL。
3)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液补足到 20μL。
4)在各孔中加入200μL BCA工作液，使用加样枪轻柔吹打，将其中液体混匀，然后在37℃室内放置30～60min。将液体冷却至室温，在酶标仪上测定562nm波长下的吸光值，最后根据标准曲线计算出蛋白质的浓度(mg/L)。
(3)电子传递体系(ETS)活性测定
ETS活性采用INT-ETS方法测定，该方法的原理为：以碘硝基四氮唑[2-(ρ-iodophenyl)-3-(ρ-nitrophenyl)-5-phenyl Tetrazolium Chloride，INT]为人工电子受体，INT在接受电子后产生紫红色的还原产物三苯基甲酯，从而可间接反映微生物的活性。ETS具体检测步骤如下：
取菌液取1mL以8000rpm离心5min，弃去上清液，样品用PBS 缓冲溶液(pH=8.4)洗涤离心处理3次，最后用PBS缓冲液(pH=8.4) 补足至取样体积并混合均匀。加入0.5mL0.2%INT溶液、2mL 0.1mol/L 葡萄糖溶液，在37℃下避光振荡培养1h。加入甲醛(添加量为样品量的2%)终止反应，再离心3min(10000rpm)，弃去上清液，加入1mL 乙醇，1mL丙酮，在(37±1)℃下暗处振荡萃取15min。在10000rpm 下离心3min，取上层溶液于485nm处测定吸光度值，即得。
