申请日2018.11.14
公开(公告)日2019.01.15
IPC分类号C12Q1/689; C12Q1/04; C12Q1/686
摘要
一种检测活性污泥中死菌或休眠菌的方法，属于污水生物处理技术领域。本发明可以检测污水处理厂活性污泥中的死菌或休眠菌，从基因和转录水平上分析菌群特点。对活性污泥提取DNA和RNA，将RNA反转录为cDNA，采用QPCR和RT‑PCR(反转录PCR)技术对其进行定量分析，即可得到死菌或休眠菌的数量。此外，对活性污泥的DNA和cDNA采用高通量测序技术分析，通过菌种的相对丰度值，即可判断该菌种是否为死菌或者休眠菌。本发明提供了一种经济、简便、可靠的检测活性污泥中死菌或休眠菌的方法，为实际污水处理厂分析活性功能菌提供了理论支撑。
权利要求书
1.一种检测活性污泥中死菌或休眠菌的方法，其特征在于：对活性污泥提取DNA和RNA，将RNA反转录为cDNA后对DNA和cDNA采用高通量测序技术分析，对于DNA高通量测序中菌种的相对丰度不等于0，而cDNA高通量测序相对丰度为0的，即认为该菌种为死菌或者休眠菌;利用实时定量PCR技术对活性污泥的DNA和cDNA进行定量分析，即得到死菌或休眠菌的细胞数。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将RNA反转录为cDNA具体为：
(1)提取活性污泥的DNA和RNA
(2)通过反转录试剂盒将提取的RNA去除基因组DNA：
于冰上配制如下10μL反应混合液：加入2.0μL的5×gDNA Eraser Buffer，1.0μL的gDNAEraser，不超过1μg的Total RNA，最后用RNase Free dH2O补充至10μL，混匀后在42℃下反应2分钟得到混合液;
(3)利用反转录试剂盒进行反转录反应：
于冰上配制如下20μL反应混合液：加入1.0μL的PrimeScript RT Enzyme Mix I溶液，1.0μL的RT Primer Mix，4.0μL的5×PrimeScript Buffer 2溶液，4.0μL的RNase FreedH2O和10μL的上述(2)混合液;上述20μL反应混合液在37℃下反应15分钟，然后在85℃下反应5秒得到cDNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，实时定量PCR具体为：
在实时定量PCR仪上，利用全菌16S rRNA正向引物1055F：ATGGCTGTCGTCAGCT，反向引物1392R：ACGGGCGGTGTGTAC对DNA和cDNA进行Q-PCR和RT-PCR即反转录PCR定量分析;扩增程序为：95℃预变性10min;95℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸20s，45个循环;Q-PCR和RT-PCR定量分析的差值即为死菌或休眠菌的拷贝数，该值除以全菌16S rRNA在细胞中的拷贝数，得到死菌或休眠菌的细胞数。
说明书
一种检测活性污泥中死菌或休眠菌的方法
技术领域
本发明涉及一种检测活性污泥中死菌或休眠菌的方法，属于污水生物处理技术领域，用于对污水生物处理系统中死菌或者休眠菌进行鉴定。
背景技术
近年来，虽然污水处理率不断提高，但是由氮、磷污染引起的水体富营养化问题不但没有解决，反而日益严重，为了防止水体富营养化问题继续恶化，对城镇污水处理厂污染物的排放标准中对氮和磷的排放提出了更高的要求。因此，对污水生物脱氮除磷机理的研究日益成为当前污水处理研究的热点。在污水强化生物脱氮除磷系统中，微生物的的菌群结构及代谢活性决定生物脱氮除磷的处理效果。生物脱氮技术主要包括硝化作用和反硝化作用，以实现氮的去除。硝化作用是在有氧条件下，硝化菌将NH4+-N硝化为NO2--N或NO3--N。其中的功能微生物包括将NH4+-N氧化为NO2--N的氨氧化细菌(Ammonium oxidizingbacteria，AOB)和将NO2--N氧化为NO3--N的亚硝酸盐氧化细菌(Nitrite oxidizingbacteria，NOB)。反硝化阶段即反硝化菌利用废水中的碳源作为电子受体将NO2--N或NO3--N还原为N2排放到大气中。生物除磷包括传统生物除磷和反硝化除磷，两者的主要区别是吸磷过程中氧化PHA的电子受体是O2，还是NO2-或NO3-。强化生物除磷技术中功能微生物为聚磷菌。聚磷菌在厌氧条件下释放磷，然后在好氧条件下过量吸磷，通过排泥从污水中除去部分磷，以达到减少污水中磷含量的目的。分子生物学方法的出现使我们能够更好地理解污水处理系统中微生物的系统发育和功能多样性，为生物废水处理研究提供新的思路。在转录水平上对生物脱氮除磷污水处理系统中的菌群结构、活性等进行研究分析，能够为污水生物脱氮系统的长期稳定运行提供有力保障。
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。SYBR GreenⅠ法：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。反转录PCR，是指以mRNA在反转录酶作用下合成的cDNA第一链为模板的PCR。该反应分为两步，第一步在单引物的介导和反转录酶的催化下合成RNA的互补链cDNA;第二步加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链DNA,最后同常规PCR一样，扩增靶DNA。高通量测序是一种更为敏感的测序分析方法，可以更好地描述微生物群落的组成和结构。RNA是细胞活性的指标，与细胞分裂无关，这点与DNA不同。基因水平和转录水平的结合可以更好地揭示哪些基因在哪些环境下表达，但是这方面的研究却很少。
本发明采用QPCR和RT-PCR(反转录PCR)技术对活性污泥DNA和cDNA进行定量分析，并利用DNA和cDNA高通量分析技术，从而检测活性污泥中的死菌或休眠菌。本发明在技术上不同于现有技术，主要体现在以下两方面：
(1)菌群分析水平。现有技术对菌群的研究主要体现在基因水平层次上，从活性污泥中提取的DNA包括有活性的菌群，同时也包括死菌和休眠菌。基因水平研究污水处理无法确定系统内真正发挥作用的菌群以及微生物的表达情况，对生物脱氮除磷的机理研究不够深入。因此，本发明在转录水平上利用RT-PCR和cDNA高通量测序技术并与基因水平分析相结合，在不改变微生物生长条件的情况下，能够对污水处理系统的菌群结构进行更深层次的研究。
(2)基因分析方法。常规分子生物学QPCR技术是针对活性污泥中的特定基因进行定量分析，所得结果为该基因的拷贝数，DNA高通量测序技术是针对不同分类学水平进行的测序分析。本发明是利用全菌16S rRNA引物，对DNA和cDNA进行QPCR和RT-PCR(反转录PCR)定量分析，两者之间的差值即为死菌或休眠菌的拷贝数，该值除以每个细胞中全菌16SrRNA的拷贝数，即可得到死菌或休眠菌的细胞数。此外，对DNA和cDNA采用高通量测序技术分析，对于DNA高通量测序中菌种的相对丰度不等于0，而cDNA高通量测序相对丰度为0的，即可认为该菌种为死菌或者休眠菌。本发明对分析难度较大的污水处理系统中死菌或休眠菌的鉴定提供了新方法。
故本发明利用QPCR和RT-PCR技术进行定量分析死菌或休眠菌的数量，对活性污泥的DNA和cDNA采用高通量测序技术分析，通过菌种的相对丰度值判断该菌种是否为死菌或者休眠菌，未见相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可靠的检测活性污泥中死菌或休眠菌的方法。利用转录水平分析活性菌群的特性，对活性污泥提取DNA和RNA并将RNA反转录为cDNA，利用QPCR和RT-PCR技术进行定量分析，即可得到死菌或休眠菌的数量。此外，对活性污泥的DNA和cDNA采用高通量测序技术分析，通过菌种的相对丰度值，即可判断该菌种是否为死菌或者休眠菌。可用于污水处理厂活性污泥系统中鉴定死菌或休眠菌，指导实际污水处理厂的运行调控，具有很好的应用前景。
本发明的技术方案：
一种检测活性污泥中死菌或休眠菌的方法，其特征在于：对活性污泥提取DNA和RNA，用反转录试剂盒(Takara,Dalian,China)将RNA反转录为cDNA，采用实时定量PCR技术并利用全菌16S rRNA引物，在Mx3005P实时荧光定量PCR仪上(Agilent Technologies,USA)对DNA和cDNA进行QPCR和RT-PCR(反转录PCR)定量分析，两者之间的差值即为死菌或休眠菌的拷贝数，该值除以每个细胞中全菌16S rRNA的拷贝数，即可得到死菌或休眠菌的细胞数。此外，对DNA和cDNA采用高通量测序技术分析，对于DNA高通量测序中菌种的相对丰度不等于0，而cDNA高通量测序相对丰度为0的，即可认为该菌种为死菌或者休眠菌。
