申请日2017.12.07
公开(公告)日2018.05.01
IPC分类号G01N30/06; G01N30/08; G01N30/88
摘要
一种厌氧颗粒污泥中雌二醇含量的检测方法，属于污泥分析技术领域。本方法将采集好的厌氧颗粒污泥泥样冷冻干燥，采用甲醇作为萃取剂对泥样中的雌二醇进行超声萃取，萃取液稀释后高速离心，上清液经过真空抽滤后采用固相萃取柱富集其中的雌二醇，采用乙酸乙酯将雌二醇从固相萃取柱上洗脱下来，经过氮气吹干浓缩、衍生化后得到待测液，结合内标法，利用气相色谱‑串联质谱联用分析雌二醇浓度。本方法可作为快速溶剂萃取法的替代方法，对泥样中的雌二醇含量进行测定，回收率为92.1±2.4%。
权利要求书
1.一种厌氧颗粒污泥中雌二醇含量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)污泥样品萃取
对采集的污泥样品进行冷冻干燥处理，以甲醇为萃取剂，使用超声仪超声萃取，将萃取液以甲醇/蒸馏水=1:20(v/v)进行稀释，离心，收集上清液，重复两次，将所得上清液合并;
(2)上清液净化
将上述上清液经过真空抽滤后采用固相萃取柱(SPE柱)净化富集其中的雌二醇，采用乙酸乙酯将雌二醇从固相萃取柱上洗脱下来，加入内标物，经过氮气吹干、衍生化后得到待测液;
(3)利用气相色谱-串联质谱联用法分析雌二醇含量，得到雌二醇与内标物峰面积之比;
(4)标准曲线的绘制，以内标法进行定量测定
所述的内标法标准曲线绘制：利用分析天平准确称量雌二醇，溶于色谱纯甲醇内，配制成系列浓度的雌二醇标准溶液，均加入内标物，使用步骤(3)气相色谱-串联质谱联用对标准溶液进行分析，以雌二醇浓度为横坐标，雌二醇与内标物峰面积之比为横坐标进行回归并得到标准曲线;
(5)样品及回收率的测定
采集待测厌氧颗粒污泥样品，按步骤(1)对污泥样品进行萃取，再按步骤(2)进行萃取液的净化，最后用步骤(3)的气相色谱-串联质谱联用方法进行样品检测，并与步骤(4)得到的标准曲线进行比较，通过换算最终得到待测污泥样品中雌二醇的含量。
2.按照权利要求1所述的一种厌氧颗粒污泥中雌二醇含量的检测方法，其特征在于，步骤(3)气相色谱-串联质谱联用仪：Agilent 6890-5973气相色谱-串联质谱联用系统;
色谱柱：Agilent HP-5MS色谱柱;
气相色谱柱箱温度升温程序：100℃保持1min，然后以10℃/min升至200℃，再以3℃/min升至300℃，最后在300℃保持10min;
质谱条件：接口温度为280℃，离子源温度为230℃。
3.按照权利要求1所述的一种厌氧颗粒污泥中雌二醇含量的检测方法，其特征在于，步骤(3)待测液和步骤(4)标准液中内标物的浓度相同。
4.按照权利要求1所述的一种厌氧颗粒污泥中雌二醇含量的检测方法，其特征在于，超声萃取波频为20kHz，超声时间为15min。
5.按照权利要求1所述的一种厌氧颗粒污泥中雌二醇含量的检测方法，其特征在于，内标物为雌二醇的同位素化合物氘代雌二醇。
6.按照权利要求1所述的一种厌氧颗粒污泥中雌二醇含量的检测方法，其特征在于，固相萃取柱在使用前先依次用乙酸乙酯、甲醇、超纯水过柱进行活化。
7.按照权利要求1所述的一种厌氧颗粒污泥中雌二醇含量的检测方法，其特征在于，上清液通过固相萃取柱后，采用50%甲醇水溶液淋洗萃取柱以洗去杂质，之后再采用乙酸乙酯溶出萃取柱中的雌二醇。
8.按照权利要求1所述的一种厌氧颗粒污泥中雌二醇含量的检测方法，其特征在于，衍生化方法为：将加入内标物的洗脱液用氮气吹干后，加入衍生化试剂Bstfa、吡啶，在温度70℃衍生化30min，每2-5g步骤(1)的污泥样品得到的洗脱液对应100μl衍生化试剂Bstfa、50μl吡啶。
说明书
一种厌氧颗粒污泥中雌二醇含量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种厌氧颗粒污泥中雌二醇含量的检测技术，特别是涉及采用超声萃取-固相萃取-气相色谱-串联质谱联用技术对厌氧颗粒污泥中雌二醇含量的检测方法，属于污泥分析技术领域。
背景技术
雌二醇(17β-Estradiol，E2)作为一类典型的内分泌干扰物，在极低的浓度水平下(μg/l至ng/l)即可干扰人类和野生动物的内分泌系统，引发水生鱼类雌雄同体、雄鱼雌性化等现象。相关调查研究表明，雌二醇在污水厂出水、雨水、井水、湖泊、海洋、饮用水等水体中均有分布，对生态安全构成了潜在威胁。针对各类水体尤其是污水中雌二醇的去除研究已引起了许多国家的重视。
有研究表明，相比于好氧活性污泥法，厌氧颗粒污泥虽然也可以降解雌二醇，但却表现出更明显的吸附、积累雌二醇的倾向。由于剩余污泥常被填埋处理，亦可被作为肥料进行土地利用，污泥中吸附、积累的雌二醇有可能污染农作物及地下水，对人类健康造成潜在威胁，因此检测厌氧颗粒污泥中雌二醇的含量具有重要意义。
由于厌氧颗粒污泥基质复杂，泥相中雌二醇含量的分析难度高于水相，因此，建立回收率高、重现性好、精确度高、易于操作的的厌氧颗粒污泥中雌二醇含量的检测方法是研究的关键。超声萃取具有效率高、时间短、简单易行的特点，且萃取温度低，适用于遇热不稳定的雌二醇的萃取。固相萃取(SPE)技术是一种操作简便、重复性好、回收率高的富集净化技术，可以有效地实现分析物与干扰物的分离。对雌二醇含量进行仪器分析时，将气相色谱(GC)与质谱(MS)联用，可以极大地提高灵敏度与精确度、降低检测限。
发明内容
本发明的目的是针对厌氧颗粒污泥基质复杂、前处理难度大、雌二醇痕量存在等问题，拟开发一种回收率高、灵敏度高、简便易行、重现性好的分析技术，实现对厌氧颗粒污泥样品中痕量雌二醇的定量分析检测。
本发明的技术方案如下：
一种厌氧颗粒污泥中雌二醇含量的检测方法，该方法包括如下步骤：
(1)污泥样品萃取
对采集的污泥样品进行冷冻干燥处理，以甲醇为萃取剂，使用超声仪超声萃取，将萃取液以甲醇/蒸馏水=1:20(v/v)进行稀释，离心(优选在10000rpm下离心10min)，收集上清液，重复两次，将所得上清液合并;
(2)上清液净化
将上述上清液经过真空抽滤后采用Waters公司Oasis HLB 3cc(60mg)固相萃取柱(SPE柱)净化富集其中的雌二醇，采用乙酸乙酯将雌二醇从固相萃取柱上洗脱下来，加入内标物，经过氮气吹干、衍生化后得到待测液;
(3)气相色谱-串联质谱联用法分析雌二醇含量
利用气相色谱-串联质谱联用法分析上述待测液中雌二醇含量，得到雌二醇与内标物峰面积之比;
优选：气相色谱-串联质谱联用仪：Agilent 6890-5973气相色谱-串联质谱联用系统(美国Agilent公司)。
色谱柱：Agilent HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm，美国Agilent公司)
气相色谱柱箱温度升温程序：100℃保持1min，然后以10℃/min升至200℃，再以3℃/min升至300℃，最后在300℃保持10min。
质谱条件：接口温度为280℃，离子源温度为230℃。
(4)标准曲线的绘制，以内标法进行定量测定
所述的内标法标准曲线绘制：利用分析天平准确称量雌二醇，溶于色谱纯甲醇内，配制成系列浓度的雌二醇标准溶液，均加入内标物，使用步骤(3)气相色谱-串联质谱联用对标准溶液进行分析，以雌二醇浓度为横坐标，雌二醇与内标物峰面积之比为横坐标进行回归并得到标准曲线(如参考图1)，用于计算待测样品中雌二醇的量;图2为雌二醇标准样品的气相色谱-串联质谱谱图。
(5)样品及回收率的测定
采集待测厌氧颗粒污泥样品，按步骤(1)对污泥样品进行萃取，再按步骤(2)进行萃取液的净化，最后用步骤(3)的气相色谱-串联质谱联用方法进行样品检测，并与步骤(4)得到的标准曲线进行比较，通过换算最终得到待测污泥样品中雌二醇的含量。
进一步优选步骤(3)待测液和步骤(4)标准液中内标物的浓度相同。
本发明所述的超声萃取波频为20kHz，超声时间为15min。
本发明所述的内标物为雌二醇的同位素化合物氘代雌二醇。
本发明所述的固相萃取柱在使用前先依次用乙酸乙酯、甲醇、超纯水过柱进行活化。
本发明所述的上清液通过固相萃取柱后，采用50%甲醇水溶液淋洗萃取柱以洗去杂质，之后再采用乙酸乙酯溶出萃取柱中的雌二醇。
本发明所述的衍生化方法为：将加入内标物的洗脱液用氮气吹干后，加入衍生化试剂Bstfa、吡啶，在温度70℃衍生化30min，每2-5g步骤(1)的污泥样品得到的洗脱液对应100μl衍生化试剂Bstfa、50μl吡啶。
本发明的有益效果是：采用超声萃取，效率高、时间短、简单易行，且萃取温度低，适用于遇热不稳定的雌二醇的萃取;采用固相萃取(SPE)技术进行富集净化，操作简便、重复性好、回收率高，可以有效地实现分析物与干扰物的分离;采用气相色谱-串联质谱联用法进行检测，检测限低、灵敏度高、精确度高。本发明提供一种回收率高、灵敏度高、简便易行、重现性好的分析技术，能够快速实现对厌氧颗粒污泥样品中痕量雌二醇的定量分析检测。
