申请日2016.04.28
公开(公告)日2016.08.03
IPC分类号C12Q1/06; C12R1/01
摘要
本发明涉及一种污水处理厂聚磷菌的快速定量方法，具体步骤包括污水处理厂活性污泥样品采集和保藏、制作无菌明胶涂片、制作样品涂片、亚甲基蓝染色、DAPI染色、显微镜观察、聚磷菌丰度的确定及统计分析等步骤。根据该方法，可以简单快速从复杂废水处理系统混合微生物群落中定量聚磷菌，操作流程快速，成本较低，操作简便，操作人员不需要特殊的技能培训，对检测的地点和时间无特殊的要求，检测结果准确，并能迅速提供给城市污水处理厂技术人员相关的数据，可作为监测强化生物除磷过程异常的原因和依据，对进一步调整工程控制措施，保证城市污水处理厂强化生物除磷过程的正常运行具有重要的意义。
权利要求书
1.一种污水处理厂聚磷菌的快速定量方法，其特征在于：包括以下步骤：
污水处理厂活性污泥样品采集和保藏：在曝气装置后的曝气区进行采样，样品存入广口玻璃瓶中，并在1小时内转运到实验室，样品在实验室存放于离心管中，置于4℃冰箱中保存，染色实验在三天内完成;
制作无菌明胶涂片：无菌状态下，取7个载玻片架，将载玻片填满于载玻片架中;在3.5L蒸馏水中加入4-5滴广州立白企业集团有限公司生产的1升装的立白洗涤精，放入载玻片架，煮沸10min;取出载玻片架，晾3min;用蒸馏水将洗涤剂冲洗干净，将载玻片保持直立状态晾干;在3.5L蒸馏水中加入2.5g的十二水硫酸钾铬和0.44g的明胶，加热至70℃，待明胶基本溶解后放入载玻片架，恒温10min;取出载玻片架，将载玻片斜立于试管架边上干燥即得;
制作样品涂片：无菌状态下，将装有样品的离心管在匀质器上摇匀,由于样品中有的颗粒体积较大,移液枪枪头在使用前将前端剪去2-3毫米,用移液枪取20ul混合活性污泥样品，该混合活性污泥样品按干重计量为8-10g/L的混合液体，置于载玻片中央，盖上另外一片同样处理的载玻片，用手拉住两片载玻片的末端朝相反的方向来回拉动10-20次，将载玻片立靠在试管架边缘,使其风干;
亚甲基蓝染色：取10-15ml亚甲基蓝染色液滴于风干的样品载玻片上，染色15s后将染色液倒去，并用70%的酒精冲洗30s,置于阴凉处风干;
DAPI染色：取100-200ul染色剂DAPI覆盖于风干的载玻片上均匀涂开，并置于黑暗的无菌操作箱中染色10-20min;将染色剂DAPI倒去，并用蒸馏水小心冲洗2-3遍，每次1min;避光并在无菌操作箱中风干;
显微镜观察：将干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上，100×的物镜下进行观察和拍照，每个样品至少采集30套数据图片，每套数据图片包括一张步骤(4)处理过的亚甲基蓝染色图片和一张步骤(5)处理过的DAPI染色图片;
聚磷菌丰度的确定及统计分析：使用图像分析软件ImageJ分别分析同一套数据图片中的亚甲基蓝染色阳性聚磷菌细胞数和DAPI染色阳性的细胞数，亚甲基蓝染色阳性聚磷菌细胞采用ImageJ中提供的手动计数法计数，DAPI染色细胞采用自动计数法计数：
聚磷菌的丰度=亚甲基蓝染色阳性聚磷菌细胞数/细胞总数×100%
t检验和方差分析均在excel中完成。
2.根据权利要求1所述的污水处理厂聚磷菌的快速定量方法，其特征在于：步骤(4)所述亚甲基蓝染色剂的配制方法为：
A液的配制：质量比10-20%的KOH溶液;
B液的配制：按质量比亚甲基蓝：酒精=1:33-50;
亚甲基蓝染色剂的配制：将A液与B液按体积比1:0.5-1混合。
3.根据权利要求1所述的污水处理厂聚磷菌的快速定量方法，其特征在于：步骤(5)所述DAPI染色液为浓度0.0003-0.005mg/ml的DAPI水溶液。
说明书
污水处理厂聚磷菌的快速定量方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物的快速定量方法，特别是一种污水处理厂聚磷菌的快速定量方法。
背景技术
随着城镇化的发展，城市及工业污水排放引起的水体富营养化问题越来越突出，其主要原因是含氮、磷污水的过量排放，因此必须对污水进行处理。城市及工业污水中的磷可以采用物理、化学和生物处理法去除，与传统的物理和化学方法相比，生物处理法在去除污水中污染物方面有着无可比拟优势，例如：无需通过高温高压，在温和条件下即可完成对污水的处理，因此处理费用低廉;由于城市废水中所含的微生物代谢类型多样，可以对大多数污水的污染物实现生物降解;而且污水生物处理不产生附加的废弃物，对环境的影响较小。因此，以活性污泥为主体的污水处理过程已成为现代社会最大的生物技术产业。
活性污泥法是一种对污水的好氧生物的处理方法。活性污泥是废水微生物处理中微生物悬浮在水中的各种物质的统称。活性污泥法的本质是从污水中去除溶解的和胶体状态的有机物以及能被活性污泥吸附的悬浮固体和其他一些物质，同时也能去除一部分磷和氮。
活性污泥是由细菌、放线菌、真菌和原生动物组成的絮状体构成，活性污泥法的原理是向废水中连续的通入空气，经一定时间后因好氧微生物繁殖，而形成了污泥状絮凝物。其上栖息着各种微生物群，具有很强的吸附能力与氧化有机物的能力，用来分解去除污水中的有机污染物。这样就可以使污泥与水分离，而且大部分污泥再回流到曝气池，能再次利用，多余部分则排出该系统。
目前生物除磷的重要途径是强化生物除磷技术(enhancedbiologicalphosphorusremoval，EBPR)。生物处理法中生物除磷是一个重要的过程，利用了活性污泥中一种特殊微生物的超量磷吸收的现象，即该微生物吸收的磷量超过自身正常生长所需的磷量，这种特殊的微生物就是聚磷菌。强化生物除磷主要通过聚磷菌(phosphateaccumulatingorganisms，PAOs)在厌氧条件下释放磷，在好氧条件下过量吸收磷，而后排放富含磷的剩余污泥，进而达到将磷从污水中去除的目的。由聚磷菌通过强化生物脱磷过程完成的去除污水中的磷的具体过程是：在污水与活性污泥混合后通过厌氧区、兼性厌氧区和好氧区的流程中，首先活性污泥中的聚磷菌在厌氧区利用体内多聚磷酸盐(polyphosphate,polyP)为能源，吸收污水中的短链脂肪酸并将其储存为体内的聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)，并向细胞外释放磷酸盐，当进入兼性厌氧期和好氧区后，聚磷菌利用体内的聚羟基脂肪酸酯为能源吸收污水中的磷(PO4-)，储存为体内的多聚磷酸盐，同时完成生长过程。在强化生物除磷过程中在好氧区的末期通过排放富含磷的剩余活性污泥就达到了从污水中去除磷的目的。
聚磷菌能在好氧情况下将污水中超量的磷吸入自身体内，使体内的磷含量为一般细菌含磷量的数倍，而在厌氧区，聚磷菌会分解体内一部分的多聚磷酸盐，用以维持自身生存，因此聚磷菌被广泛地应用于生物除磷。微生物遵循生长曲线的规律，在厌氧区中，聚磷菌细胞会从废水中摄取大量溶解态的磷酸盐，在细胞内合成多聚磷酸盐，并储存在细胞内，供给生长时期所需要的合成核酸时的磷素;当活性污泥中的聚磷菌在营养丰富的环境中生活时，进入对数生长期，在对数生长期聚磷菌会大量分裂;之后聚磷菌进入静止期，大部分细胞停止繁殖，核酸的合成也随之停止，此时聚磷菌对磷的需要量很低，但若环境中的磷源仍有剩余，细胞又有一定的能量时，仍能从外界吸收磷元素，将磷以多聚磷酸盐的形式储存于细胞内，作为细胞贮存物质，这种对磷的积累作用使聚磷菌能够聚集大大超过其生长所需的磷量;当细菌细胞处于极为不利的生活条件时，聚磷菌又能吸收污水中的乙酸、甲酸、丙酸及乙醇等极易生物降解的有机物质，贮存在体内作为营养源，同时将体内存贮的聚磷酸盐分解，以便获得能量，供细菌在不利环境中维持其生存所需，此时菌体内多聚磷酸盐就逐渐消失;如果该类细菌再次进入营养丰富的好氧环境时，它将重复体内积磷的过程。
污水处理过程中很多生物和非生物因素都会影响强化生物除磷过程的效率，例如糖源积累细菌(glycogenaccumulatingorganisms,GAO)可以与聚磷菌在厌氧期竞争吸收同样的有机基质，从而减少了聚磷菌在厌氧期聚羟基脂肪酸酯的积累，导致了它们在好氧期和兼性厌氧期的磷吸收减少;此外，污水特征如C/N比、pH值和温度等的变化，也会影响磷去除的效率，甚至会造成强化生物除磷过程的完全崩溃。
为了污水的有效处理和达标排放，污水处理厂管理和操作人员需要监控和及时判断影响强化生物除磷过程异常的原因，以便对活性污泥流程和工厂设施进行必要的调整，保证强化生物除磷过程的正常运行，保证污水的达标排放。
在现有的物理化学和生物指标中，活性污泥微生物群落中聚磷菌的相对丰度和活性直接反应强化生物除磷过程运行状况，是强化生物除磷过程监控的良好指标。但是，目前用于聚磷菌的检测方法较少，目前主要采用以聚磷菌16SrRNA为靶标的基因探针通过定量荧光原位杂交(quantitativefluorescenceinsituhybridization,qFISH)和通过qPCR定量聚磷菌的丰度和活性的方法检测。qFISH是利用荧光标记的特异核酸探针按照碱基互补配对原则，与细胞内相应的DNA分子杂交，形成可被检测的双链核酸，通过荧光显微镜可观察到荧光信号。qPCR是在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积，监测PCR的进程，最后通过标准曲线对聚磷菌进行定量分析。但目前两种检测的方法操作复杂，操作人员需要一定的专业技能，检测时间过长(7-8小时)，实验过程所需材料及设备也比较昂贵，不适于作为简单快速的检测方法。因此，建立一种简单、快捷、高效、低成本的聚磷菌检测方法，适用于活性污泥脱磷效果和污水处理厂设备工作效率的常规检测，对保护水资源环境和人民的生活水平有着重大的意义。
发明内容
本发明提供了一种污水处理厂聚磷菌的快速定量方法，开发了一种简单快速从复杂废水处理系统混合微生物群落中定量聚磷菌的手段，亚甲基蓝染色和DAPI染色联用可在1-2小时内定量城市污水处理厂活性污泥强化生物除磷过程中的聚磷菌，而且操作过程简单快速，操作人员不需要专业技能培训，聚磷菌的丰度和活性可用于监控污水处理厂强化生物除磷过程运行的状况、判断强化生物除磷过程异常的原因，并能及时采取正确的工程控制措施，保证城市污水处理厂的正常有效运行。
为达到上述目的，本发明包含以下步骤：
(1)污水处理厂活性污泥样品采集和保藏：在曝气装置后的曝气区进行采样，样品存入广口玻璃瓶中，并在1小时内转运到实验室。样品在实验室存放于离心管中，置于4℃冰箱中保存，染色实验在三天内完成。
(2)制作无菌明胶涂片：无菌状态下，取7个载玻片架，将载玻片填满于载玻片架中;在3.5L蒸馏水中加入4-5滴洗涤剂，放入载玻片架，煮沸10min;取出载玻片架，晾3min;用蒸馏水将洗涤剂冲洗干净，将载玻片保持直立状态晾干;在3.5L蒸馏水中加入2.5g的十二水硫酸钾铬和0.44g的明胶，加热至70℃，待明胶基本溶解后放入载玻片架，恒温10min;取出载玻片架，将载玻片斜立于试管架边上干燥即得。
(3)制作样品涂片：无菌状态下，将装有样品的离心管在匀质器上摇匀,由于样品中有的颗粒体积较大,枪头在使用前将前端剪去2-3毫米,用移液枪取约20ul混合活性污泥样品[8-10g/L混合液体(干重计量)]置于载玻片中央，盖上另外一片同样处理的载玻片，用手拉住两片载玻片的末端朝相反的方向来回拉动10-20次，将载玻片立靠在试管架边缘,使其风干。
(4)亚甲基蓝染色：取10-15ml亚甲基蓝染液滴于风干的样品载玻片上，染色15s后将染液倒去，并用70%的酒精冲洗30s,置于阴凉处风干。
(5)DAPI染色：取100-200ul染色剂D覆盖于风干的载玻片上均匀涂开，并置于黑暗的无菌操作箱中染色10-20min;将染色剂D倒去，并用蒸馏水小心冲洗2-3遍(每次1min);避光并在无菌操作箱中风干;
(6)显微镜观察：将干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上，100×的物镜下进行观察和拍照，每个样品至少采集30套(每套数据图片包括一张亚甲基蓝染色图片和一张DAPI染色图片)数据图片;
(7)聚磷菌丰度的确定及统计分析：使用图像分析软件ImageJ分别分析同一套数字图片中的亚甲基蓝染色阳性聚磷菌细胞数和DAPI染色阳性的细胞数(微生物总数)，亚甲基蓝染色阳性聚磷菌细胞采用ImageJ中提供的手动计数法计数，DAPI染色细胞采用自动计数法计数：
聚磷菌的丰度=亚甲基蓝染色阳性聚磷菌细胞数/细胞总数×100%
t检验和方差分析均在excel中完成。
优选地，所述亚甲基蓝染色剂的配制方法为：
a)A液的配制：质量比10-20%的KOH溶液;
b)B液的配制：亚甲基蓝：酒精=1:33-50(质量比);
c)亚甲基蓝染色剂的配制：将A液与B液按体积比(1:0.5-1)混合。
优选地，所述DAPI染液为浓度0.0003-0.005mg/ml的DAPI水溶液。
本发明中，通过把亚甲基蓝染色法与DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)染色法联用，探索出一种简单快速定量活性污泥微生物群落中聚磷菌的方法。方法的原理是：亚甲基蓝染料带正电荷，而多聚磷酸盐颗粒带负电荷，因此二者具有很高的亲和力，两者结合后染料的光吸收性发生变化，产生不同的颜色能够区分异染颗粒与细胞。在亚甲基蓝染色中亚甲基蓝能够与聚磷菌体内的多聚磷酸盐发生显色反应，生色团可以用常规显微镜进行观察，而且它们的强度与多聚磷酸盐的量成正比，因此可用于指示潜在的聚磷菌的活性。因此可以采用亚甲基蓝染色法来标记污水处理厂活性污泥微生物群落中的聚磷菌，可以采用DAPI染色标记活性污泥微生物群落中的所有微生物细胞，DAPI作为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞。结合两种方法，并通过荧光显微镜图片计算出同一视野中聚磷菌占所有微生物细胞的百分比。至今为止，这两种方法还从未联合使用过，该方法的成功开发将能够快速准确的测定污水处理厂活性污泥中聚磷菌的丰度，掌握和判断污水处理厂的工作状况。
本发明首次将亚甲基蓝染色法与4',6'-二脒基-2-苯吲哚盐酸(DAPI)(4',6’-diamidino-2-phenylindole)染色法联用，探索出一种简单快速的定量活性污泥微生物群落中聚磷菌的方法。亚甲基蓝染色和DAPI染色联用可在1-2小时内定量城市污水处理厂活性污泥强化生物除磷过程中的聚磷菌，而且操作过程简单快速，操作人员不需要专业技能培训，聚磷菌的丰度和活性可用于监控污水处理厂强化生物除磷过程运行的状况、判断强化生物除磷过程异常的原因，并能及时采取正确的工程控制措施，保证城市污水处理厂的正常有效运行。
本发明开发了一种简单快速从复杂废水处理系统混合微生物群落中定量聚磷菌的手段，此手段和目前的分子生物学方法(qFISH和qPCR)比较，克服了现有的方法的不足，特点是快速(可以在1-2小时内完成)，成本较低，操作简便，操作人员不需要特殊的技能培训，对检测的地点和时间无特殊的要求，检测结果准确，并能迅速提供给城市污水处理厂技术人员相关的数据，可作为监测强化生物除磷过程异常的原因和依据，对进一步调整工程控制措施，保证城市污水处理厂强化生物除磷过程的正常运行具有重要的意义。
