申请日2017.03.01
公开(公告)日2017.08.04
IPC分类号C07K1/14; C08B37/00; C12N15/10; C02F11/00; C07K1/26
摘要
本发明公开了一种石英砂提取污泥胞外聚合物的方法及应用。所述方法包括以下步骤：S1.原位获取污泥样品，冲洗干净，吸干水分，均一化处理;S2.处理后的污泥加入石英砂和盐溶液混合，所述污泥测量其VSS，石英砂和VSS重量比为70~140:1，石英砂尺寸为32目~150目，在温度0~4℃、转速600~900rpm条件下，搅拌1~3h，得到泥砂混合液;S3.对泥砂混合液离心取上清，过滤除去杂质获得胞外聚合物粗品;S4.将胞外聚合物粗品超滤浓缩获得胞外聚合物样品。本发明获得的污泥胞外聚合物在最大程度上保持了其生物活性，基本不造成细胞破裂，无其他强酸强碱有机试剂的干扰与掩蔽，能更完整的提取胞外聚合物，同时有利于后续蛋白质组学鉴定等工作。
权利要求书
1.一种采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.原位获取污泥样品，冲洗干净，吸干水分，均一化处理;
S2.处理后的污泥加入石英砂与盐溶液混合，在温度0~4℃、转速600~900rpm条件下，搅拌1~3h，得到泥砂混合液;
S3.对泥砂混合液离心取上清，过滤除去杂质获得胞外聚合物粗品;
S4.将胞外聚合物粗品超滤浓缩获得胞外聚合物;
其中，步骤S2所述污泥测量其VSS，石英砂和VSS重量比为70~140:1，石英砂尺寸为32目~150目。
2.根据权利要求1所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，其特征在于，步骤S1所述污泥样品为含絮体形态厌氧氨氧化菌群、含颗粒形态厌氧氨氧化菌群、含生物膜形态厌氧氨氧化菌群中的一种。
3.根据权利要求1所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，其特征在于，步骤S2所述盐溶液为质量分数0.05%NaCl溶液。
4.根据权利要求1所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，其特征在于，步骤S3所述离心，离心温度为0~4℃，离心力为10000~17000g，离心时间为20~30min;所述过滤采用0.22~0.45um聚醚砜灭菌过滤器。
5.根据权利要求1所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，其特征在于，步骤S4所述超滤浓缩为采用超滤离心管在0~4℃，3000~5000g离心力条件下作用45~60min，浓缩至蛋白质浓度为1ug/uL以上。
6.根据权利要求5所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，其特征在于，所述超滤离心管型号为15mL 10KD超滤离心管。
7.权利要求1~6中任一项所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法得到的污泥胞外聚合物。
8.权利要求1~7中任一项所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法在蛋白质组学聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中的应用。
说明书
一种采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法及其应用
技术领域
本发明涉及污水生物处理中污泥胞外聚合物的提取和分析领域，尤其涉及厌氧氨氧化污泥三种不同形态菌群胞外聚合物的提取和蛋白质组学相关分析，更具体地，涉及一种采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法及其应用。
背景技术
胞外聚合物(EPS)是微生物在一定环境条件下分泌于胞外的复杂非均相高分子聚合物，主要组成为蛋白质、多糖、核酸和脂质，是菌胶团、颗粒污泥和生物膜的重要组分，是维持污泥三维网络空间的重要骨架。
EPS在污水生物处理过程中发挥重要作用：可以促进细胞的粘附;维持微生物聚集体的稳定性;减小生物毒物和非生物毒物对细胞的侵害;从环境中吸附和积累营养物质，必要时为微生物补充碳源和能源;积累、保留和稳定细胞分泌的胞外酶等。
EPS的提取是对其进行成分和功能分析的重要前提，标准方法尚未确立。同一方法对不同样品EPS提取效率不同，不同方法提取同一样品EPS效率也相差很大。不存在一种方法可将样品EPS全部提取，所有方法在一定程度上都会造成细胞破裂。而评价一个提取方法是否合适，不仅要考虑EPS产量高低，也要考虑提取方法对细胞和EPS中大分子物质的破坏程度以及是否干扰后续测定等相关研究。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种不破坏微生物活性、无化学试剂掩蔽干扰、菌体细胞无破损的污泥胞外聚合物的物理提取方法。
本发明的另一个目的在于所述提取方法在蛋白质组学SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中的应用。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，包括如下步骤：
S1.原位获取污泥样品，冲洗干净，吸干水分，均一化处理;
S2.处理后的污泥加入石英砂和盐溶液混合，在温度0~4℃、转速600~900rpm条件下，搅拌1~3h，得到泥砂混合液;
S3.对泥砂混合液离心取上清，过滤除去杂质获得胞外聚合物粗品;
S4.将胞外聚合物粗品超滤浓缩获得胞外聚合物样品;
其中，步骤S2所述污泥测量其VSS，石英砂和VSS重量比为70~140:1，石英砂尺寸为32目~150目。
本发明利用石英砂低温中速摩擦剪切作用实现胞外聚合物与菌体的高效分离，通过控制温度、转速和时间使这种物理作用缓和不强烈。石英砂与污泥的重量配比以及石英砂尺寸对所述摩擦剪切作用具有影响：石英砂重量过小，不能与全部的污泥进行作用，过大则搅拌不均匀使得作用不充分，导致胞外聚合物与菌体不能有效分离;石英砂尺寸过小，颗粒过细很难对污泥产生剪切作用，过大则不能充分与污泥接触作用，导致胞外聚合物与菌体不能有效分离。本发明合理地选用石英砂的重量和尺寸，达到有效的摩擦剪切作用，提取的胞外聚合物的胞外生物大分子活性高、菌体细胞基本无破裂。而现有的甲醛-NaOH法、加热法等提取方法，提取的胞外聚合物易造成细胞破裂、胞外生物大分子活性降低。
步骤S1所述污泥样品为含絮体形态厌氧氨氧化菌群、含颗粒形态厌氧氨氧化菌群、含生物膜形态厌氧氨氧化菌群中的一种。
步骤S1所述冲洗可采用本领域现有技术常用溶液，如去离子水、质量分数0.05%NaCl溶液等。
优选地，步骤S2所述盐溶液为质量分数0.05%NaCl溶液，以维持细胞的渗透压。
步骤S3所述离心，离心温度为0~4℃，离心力为10000~17000g，离心时间为20~30min;所述过滤采用0.22~0.45um聚醚砜灭菌过滤器。
步骤S4所述超滤浓缩操作为采用超滤离心管在0~4℃，3000~5000g离心力下作用45~60min，浓缩至蛋白质浓度为1ug/uL以上。
所述超滤离心管型号为15mL 10KD超滤离心管。
所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法得到的污泥胞外聚合物。
所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法在蛋白质组学聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测步骤中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明公布的采用石英砂提取污泥胞外聚合物的物理方法，通过均一化、石英砂分离、离心过滤、浓缩等操作步骤，基本实现了对三种不同形态生物污泥EPS的提取。通过石英砂低温中速摩擦剪切作用实现胞外聚合物与菌体的高效分离，相比甲醛-NaOH法、加热法等提取方法，无其它试剂干扰掩蔽，胞外生物大分子活性高，细胞基本无破裂，为后续蛋白质组学鉴定等相关实验奠定了坚实的基础。
