申请日2015.10.19
公开(公告)日2016.02.10
IPC分类号C08B37/00; A61P1/16; A61P35/00
摘要
本发明涉及由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖及其提取纯化工艺和应用，由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abnp1001，其特它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖，由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abnp1002，它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，活性多糖的提取纯化工艺，它包括以下工艺步骤：材料预处理、离子交换柱层析、Sephadex?G-200凝胶柱层析，本发明取纯化的活性多糖Abnp1001、活性多糖Abnp1002具有良好的生物活性，本发明的加工工艺简单。
权利要求书
1.一种由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abnp1001，其特征在于：它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖的摩尔比为39.4:10.3:3.9:17.2:27.4。
2.一种由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abnp1002，其特征在于：它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖的摩尔比为0.13:0.56:1.57:87.1。
3.一种活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：它包括以下工艺步骤：
(1)材料预处理：收集蘑菇罐头加工过程中产生的工业废水，然后对该工业废水进行旋转蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到35～55%，得到蘑菇预煮浓缩液;量取单位体积的蘑菇预煮浓缩液，在蘑菇预煮浓缩液中加入等体积的去离子水进行混合，混合后在65-75℃水浴条件下将蘑菇预煮浓缩液中析出的晶体完全溶解，溶解之后离心机离心，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为10-20min，离心之后取上清液，上清液用 90-150KDa的超滤膜超滤，将超滤得到的截留液，按体积比为1:3.5-1:2.5的比例加入乙醇，在室温下醇沉过夜，醇沉得到的沉淀用50～100ml去离子水溶解，并于65-75℃减压蒸馏除去乙醇，再次离心机离心，离心机的转速控制在 11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为10-20min，收集上清液，即得到不小于100KDa的粗多糖Abcp，采用苯酚-硫酸法测Abcp的多糖含量， 3.5-5℃保存备用;
(2)离子交换柱层析：
a.DEAE-52预处理：将DEAE-52进行酸、碱预处理;
b.经柱层析得Abnp100;
(3)Abnp100的SephadexG-200凝胶柱层析：
a.SephadexG-200预处理;
b.经柱层析得活性多糖。
4.根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤(2) 中DEAE-52预处理的具体过程为：在DEAE-52中加入蒸馏水，浸泡过夜后抽滤，先用0.45-0.55mol/L的NaOH-NaCl碱洗，用蒸馏水洗至中性;用 0.45-0.55mol/L的HCl酸洗，用蒸馏水洗至中性;用0.45-0.55mol/L的 NaOH-NaCl浸泡，最后用蒸馏水洗至中性即可。
5.根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤(2) 的b工艺具体为：将预处理后的DEAE-52进行沸水浴脱气，脱气时间为10-20min, 脱气之后冷却装柱，用0.015-0.025mol/L、pH为7.1-7.3的Tris-HCl缓冲液洗至分层明显，之后注入DEAE-Sephadex-A50，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，定时为5～20min/管，用0.015-0.025mol/L， pH为7.1-7.3Tris-HCl缓冲液洗平衡后上Abcp，待Abcp进入DEAE-52的界面时，开始平衡洗脱，先用0.015-0.025mol/L，pH为7.1-7.3的Tris-HCl 缓冲液洗脱平衡，收集主峰A的洗脱液，用4.5-5.5KDa超滤膜超滤主峰A的洗脱液，将超滤得到的截留液进行离心机离心，离心机的转速控制在 11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为10-20min，收集上清液，此即为中性粗多糖Abnp100。
6.根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤(3) 中所述的SephadexG-200预处理的具体工艺为：将SephadexG-200干胶浸泡在蒸馏水中，不断搅拌，放置于室温下膨胀45-50h，并除去表面的碎片和沉降缓慢的细小颗粒，之后利用真空干燥器除尽凝胶液中的空气。
7.根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤(3) 的b工艺具体为：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品Abnp100，待样品完全进入填料界面时用 0.015-0.025mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为0.15-0.250mL/min，分部收集，每5～20min收集1管，每管的量是2～10mL，用苯酚-硫酸法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱谱图，收集主峰C的洗脱液，合并主峰C的洗脱液，对主峰C的洗脱液用4.5-5.5KDa 超滤膜进行超滤到9-11mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abnp1001。
8.根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤(3) 的b工艺具体为：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品Abnp100，待样品完全进入填料界面时用 0.015-0.025mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为0.15-0.250mL/min，分部收集，每5～20min收集1管，每管的量是2～10mL，用苯酚-硫酸法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱谱图，收集主峰D的洗脱液，合并主峰D的洗脱液，对主峰D的洗脱液用4.5-5.5KDa 超滤膜进行超滤到9-11mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abnp1002。
9.根据权利要求3或5所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤(2)的b步骤中：所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，DEAE-52填料填的高度为柱高的2/5-3/5，填入DEAE-Sephadex-A50的高度为8-11cm，Abcp的上样量为5-10毫升。
10.根据权利要求3或7或8所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤(3)的b步骤中：所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，Sephadex G-200填入的高度为35-45cm，Abnp100的上样量分别为为5-10毫升。
11.根据权利要求1所述的活性多糖Abnp1001的应用，其特征在于：在制备治疗急性肝损伤药物以及抗肿瘤药物中的应用。
12.根据权利要求1所述的活性多糖Abnp1002的应用，其特征在于：在制备治疗急性肝损伤药物以及抗肿瘤药物中的应用。
说明书
由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖及其提取纯化工艺和应用
技术领域
本发明涉及由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖及其提取纯化工艺和应用。
背景技术
双孢蘑菇性平、味甘，能补脾益气，润燥化痰，有滋补作用，消食，清神，平肝阳，主治消化不良，高血压,双孢蘑菇肉质肥厚,味道鲜美,而且热能低,具有很高的医疗保健作用，被联合国粮农组织誉为21世纪的健康食品，双孢蘑菇子实体中含有丰富的氨基酸、矿质元素、多糖、核甘酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰分及其超氧化物歧化酶(SOD)。
双孢蘑菇具有降低血液中的总胆固醇、超低密度脂蛋白、中密度脂蛋白、低密度脂蛋白胆固醇;双孢蘑菇能够促进CD40、CD80、CD86、主要组织相容性复合体、IL-12的表达、T细胞增殖、增高胸腺指数、脾脏指数等免疫活性;抑制乳癌细胞MCF-7aro等癌细胞的生长具有抗肿瘤活性;能显著地抑制大肠杆菌390、大肠杆菌739、产气肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等细菌的生长;具有除去大蒜所产生口腔恶臭的治疗口臭功效;可显著抑制正常小鼠的胃排空、对新斯的明负荷小鼠引起的胃排空亢进有显著的拮抗作用，具有改善胃肠道功能等活性，双孢蘑菇有这么多的功效，源于其含有丰富的营养成分和活性物质，具有相当大的开发潜力
双孢蘑菇作为世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌，其贸易以罐头为主，在双孢蘑菇罐头加工过程中清洗、预煮、灌装、注液等工艺产生大量工业废水，这些废水中往往含有大量的双孢蘑菇子实体中可溶性物质，然而诸多罐头工厂着眼于眼前利益，对双孢蘑菇罐藏预煮液没有做任何处理，直接排入环境，这不仅给环境、生态、经济协调发展造成很大的压力，而且浪费了这些废水中隐藏的有益成分，因此，有必要设计出一种能够将双孢蘑菇罐头加工过程中产生的废水中有益物质提取出来，将这些有益物质利用起来，防止资源的浪费，造福人类。
发明内容
本发明的目的在于提供具有良好生物活性的由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖及其提取纯化工艺和应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abnp1001，其特征在于：它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖的摩尔比为39.4:10.3:3.9:17.2:27.4。
一种由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abnp1002，其特征在于：它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖的摩尔比为0.13:0.56:1.57:87.1。
一种活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：它包括以下工艺步骤：
(1)材料预处理：收集蘑菇罐头加工过程中产生的工业废水，然后对该工业废水进行旋转蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到35～55%，得到蘑菇预煮浓缩液;量取单位体积的蘑菇预煮浓缩液，在蘑菇预煮浓缩液中加入等体积的去离子水进行混合，混合后在65-75℃水浴条件下将蘑菇预煮浓缩液中析出的晶体完全溶解(因为折光率高于35%就会出现晶体析出，所以需要在65-75℃水浴条件下将晶体溶解)，溶解之后离心机离心，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为10-20min，离心之后取上清液，上清液用90-150KDa的超滤膜超滤，将超滤得到的截留液，按体积比为1:3.5-1:2.5的比例加入乙醇，在室温下醇沉过夜，醇沉得到的沉淀用50～100ml去离子水溶解，并于65-75℃减压蒸馏除去乙醇，再次离心机离心，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为10-20min，收集上清液，即得到不小于100KDa的粗多糖Abcp，采用苯酚-硫酸法测Abcp的多糖含量(测Abcp的多糖含量，是为了解粗多糖Abcp含量的多少，方便进行下一步实验)，3.5-5℃保存备用;
(2)离子交换柱层析：
a.DEAE-52预处理：将DEAE-52进行酸、碱预处理;
b.经柱层析得Abnp100;
(3)Abnp100的SephadexG-200凝胶柱层析：
a.SephadexG-200预处理;
b.经柱层析得活性多糖。
步骤(2)中DEAE-52预处理的具体过程为：在DEAE-52中加入蒸馏水，浸泡过夜后抽滤，先用0.45-0.55mol/L的NaOH-NaCl碱洗，用蒸馏水洗至中性;用0.45-0.55mol/L的HCl酸洗，用蒸馏水洗至中性;用0.45-0.55mol/L的NaOH-NaCl浸泡，最后用蒸馏水洗至中性即可。
步骤(2)的b工艺具体为：将预处理后的DEAE-52进行沸水浴脱气，脱气时间为10-20min,脱气之后冷却装柱，用0.015-0.025mol/L、pH为7.1-7.3的Tris-HCl缓冲液洗至分层明显，之后注入DEAE-Sephadex-A50，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，定时为5～20min/管，用0.015-0.025mol/L，pH为7.1-7.3Tris-HCl缓冲液洗平衡后上Abcp，待Abcp进入DEAE-52的界面时，开始平衡洗脱，先用0.015-0.025mol/L，pH为7.1-7.3的Tris-HCl缓冲液洗脱平衡，收集主峰A的洗脱液，用4.5-5.5KDa超滤膜超滤主峰A的洗脱液，将超滤得到的截留液进行离心机离心，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为10-20min，收集上清液，此即为中性粗多糖Abnp100。
步骤(3)中所述的SephadexG-200预处理的具体工艺为：将SephadexG-200干胶浸泡在蒸馏水中，不断搅拌，放置于室温下膨胀45-50h，并除去表面的碎片和沉降缓慢的细小颗粒，之后利用真空干燥器除尽凝胶液中的空气。
步骤(3)的b工艺具体为：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品Abnp100，待样品完全进入填料界面时用0.015-0.025mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为0.15-0.250mL/min，分部收集，每5～20min收集1管，每管的量是2～10mL，用苯酚-硫酸法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱谱图，收集主峰C的洗脱液，合并主峰C的洗脱液，对主峰C的洗脱液用4.5-5.5KDa超滤膜进行超滤到9-11mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abnp1001。
步骤(3)的b工艺具体为：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品Abnp100，待样品完全进入填料界面时用0.015-0.025mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为0.15-0.250mL/min，分部收集，每5～20min收集1管，每管的量是2～10mL，用苯酚-硫酸法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱谱图，收集主峰D的洗脱液，合并主峰D的洗脱液，对主峰D的洗脱液用4.5-5.5KDa超滤膜进行超滤到9-11mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abnp1002。
步骤(2)的b步骤中：所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，DEAE-52填料填的高度为柱高的2/5-3/5，填入DEAE-Sephadex-A50的高度为8-11cm，Abcp的上样量为5-10毫升。
步骤(3)的b步骤中：所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，SephadexG-200填入的高度为35-45cm，Abnp100的上样量分别为为5-10毫升。
以上所述的NaCl溶液为以NaCl作溶质，0.015-0.025mol/L，pH为7.1-7.3的Tris-HCl缓冲液作溶剂配得的溶液。
所述的活性多糖Abnp1001的应用，其特征在于：在制备治疗急性肝损伤药物以及抗肿瘤药物中的应用。
所述的活性多糖Abnp1002的应用，其特征在于：在制备治疗急性肝损伤药物以及抗肿瘤药物中的应用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：1)本发明提取纯化的活性多糖Abnp1001、活性多糖Abnp1002对急性肝损伤具有良好的保护活性可以作为潜在的急性肝损伤治疗药物或者可以用于制备治疗急性肝损伤的药物;2)本发明提取纯化的活性多糖Abnp1001、活性多糖Abnp1002具有良好的抗肿瘤活性，它们可以作为潜在的抗肿瘤药物或者可以用于制备抗肿瘤药物;3)本发明将废弃的双孢蘑菇罐头加工过程中产生的工业废水作为原料，提取纯化出能够为人们所用的活性多糖，这不仅将废水变废为宝，减少了废水的排放量，降低了对环境的污染程度，而且为人们带来了具有良好生物活性的活性多糖;4)本发明的提取纯化工艺简单易实施，且得到高纯度的活性多糖。
