申请日2015.07.24
公开(公告)日2015.11.04
IPC分类号C12N1/21; C12N15/75; C02F101/38; C12R1/01; C02F3/34
摘要
本发明公开了一种基因工程好氧硝化细菌及其构建方法和在处理高浓度氨氮污水中的应用。基因工程硝化菌是表达AMO和HAO基因的重组好氧硝化细菌(具有高效去除氨氮的性能)，拉丁文学名为Brevibacillus?reuszeri，命名为Biodehiammonia菌株;保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间：30年，保藏编号CMGCC10254。基因工程好氧硝化细菌中插入外源基因AMO和HAO的核苷酸序列分别如序列编号1和2所示，基因工程硝化菌的AMO氨基酸序列如序列编号3所示，基因工程硝化菌的HAO氨基酸序列如序列编号4所示，基因工程好氧硝化细菌的AMO基因前带有分泌型信号肽，其中信号肽的氨基酸序列如编号5所示。该基因工程好氧硝化细菌与膜生物反应器联合用于污水的处理，能取得非常好的处理效果。
权利要求书
1.一种基因工程好氧硝化细菌，其特征在于，所述基因工程好氧硝化菌是 Biodeammonianitrogen工程菌，拉丁文学名为Brevibacillus reuszeri，在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CMGCC No.10254。
2.根据权利要求1所述的基因工程好氧硝化细菌，其特征在于，所述基因工程 好氧硝化细菌中转化的外源基因的核苷酸序列如序列编号1和2所示。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程好氧硝化细菌，其特征在于，所述基因 工程好氧硝化细菌的氨单加氧酶基因和羟胺氧化酶的氨基酸序列如序列编号3 和4所示。
4.根据权利要求3所述的基因工程好氧硝化细菌，其特征在于，所述基因工程 好氧硝化细菌的氨单加氧酶基因前带有分泌型信号肽，其中信号肽的氨基酸序列 如编号5所示。
5.权利要求1至4任一所述的基因工程好氧硝化细菌的构建方法，其特征在于， 包括如下步骤：
(1)利用细菌分离技术分离具有氨氮去除效果的硝化细菌基因组;
(2)利用PCR技术克隆氨单加氧酶基因和羟胺氧化酶，与pSIM6载体连 接后重组至步骤(1)的好氧硝化细菌基因组的特定位点中;
(3)利用基因工程技术从步骤(2)的产物中筛选出表达氨单加氧酶和羟胺 氧化酶基因的好氧硝化细菌;
(4)将步骤(3)的产物在高浓度氨氮条件下驯化，得到具有处理高浓度氨 氮污水能力的基因工程好氧硝化细菌;
(5)利用发酵技术将步骤(4)所述具有处理高浓度氨氮污水能力的基因工 程硝化细菌进行扩增，得到所述基因工程好氧硝化细菌。
6.权利要求1至4任一所述的基因工程好氧硝化细菌的应用，其特征在于，将 膜生物反应系统与所述基因工程好氧硝化细菌联合，在高浓度氨氮条件下，有效 去除污水中的高浓度氨氮;
所述膜生物反应系统为流动的需氧膜生物反应系统，膜的材质为树脂;
所述高浓度氨氮在所述污水中的含量是3000～6000mg/L。
7.根据权利要求6所述的基因工程好氧硝化细菌的应用，其特征在于，所述污 水中COD的去除率为98.44～99.84%。
8.根据权利要求6所述的基因工程好氧硝化细菌的应用，其特征在于，所述污 水中氨氮去除率为98.86～99.94%。
9.根据权利要求6～8任一所述的基因工程好氧硝化细菌的应用，其特征在于， 所述污水包括生活污水、工业废水、垃圾渗滤液以及高浓度氨氮废水。
说明书
一种基因工程好氧硝化细菌及其构建方法和在处理高浓度氨氮污水中的应用
发明领域
本发明涉及表达两种外源基因的重组好氧硝化细菌菌剂及其构建方法和在高 浓度氨氮污水处理中的应用，具体地说涉及表达亚硝酸盐还原酶和羟胺氧化酶的 基因工程好氧硝化细菌。
背景技术
本发明中提到的膜生物反应系统是流动的需氧的膜生物反应系统(fluidized bed membrance bioreactor,AFMBR)，基因工程好氧硝化细菌是在低温条件下具有高 效去除高浓度氨氮的Biodehiammtrogen工程菌。
随着人类活动的增多，产生的污水日益增加，高浓度氨氮污水的处理以成为 我国急需解决的问题之一。虽然现在使用的微生物处理污水，取得一定的效果， 但是大多数均不能稳定的运行。综上所述，急需新的技术和方案来解决此问题。
生物脱氮法是现代工业污水处理中最有效的去除污水中氨氮的方法，其中由 硝化细菌和反硝化细菌完成的硝化反应和反硝化反应是将氨氮从污水中去除最为 关键的步骤。自然状况下的化能无机自养硝化细菌具有生长速率低、生物量小和 对环境因子敏感等生理特点，使得污水处理厂的脱氮效果很不稳定，尤其是在处 理高浓度氨氮污水时，对硝化细菌的数量及硝化反应速率要求更高。
污水除氮的第一步就是在亚硝化细菌的作用下将铵离子转化为羟氨，在这一 步中，发挥催化作用的是氨单加氧酶和羟胺氧化酶。氨单加氧酶和羟胺氧化酶就 是异养硝化菌代谢过程中的关键酶是AMO和HAO，AMO主要催化NH3氧化形成 羟胺(NH2OH)，而羟氨又在异养硝化菌特有的不含血红素的羟氨氧化酶(HAO)的 作用下转化为亚硝酸盐或N2O。
MBR可以达到与活性污泥系统相似的处理效果，如COD的去除、硝化、反 硝化以及化学或者生物除磷。作为摸分离技术与生物技术结合的污水处理新工艺， MBR由于其出水水质优良稳定，装置占地面积小等显著优点，使其在城市污水、 工业废水、垃圾渗滤液的处理和回用方面表现出良好的竞争力，并在全球范围受 到高度重视，是公认的21世纪最具有吸引力和竞争力的污水处理与回用技术。我 国对MBR的应用与研究起步相对较晚，但是发展很快。本设计使用MBR/活性污 泥混合系统结合基因工程好氧硝化细菌增强对高浓度氨氮污水的处理的效果。
综上所述，通过本发明构建的基因工程好氧硝化细菌使MBR/基因工程细菌混 合系统对高浓度氨氮污水的处理效果得到了增强，提高了出水质量。
发明内容
鉴于以上问题，本发明的目的是提供一种基因工程好氧硝化细菌及其构建方 法和在处理高浓度氨氮污水处理中的应用。具体技术方案如下：
一种基因工程好氧硝化细菌，所述基因工程硝化菌是Biodeammonianitrogen工程 菌，拉丁文学名为Brevibacillus reuszeri，命名为Biodehiammonia菌株;保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间：2014年12月29日，保藏 编号CGMCC No.10254。
所述基因工程硝化菌中转化的外源基因的核苷酸序列如序列编号1和2所示。
所述基因工程好氧硝化细菌表达的氨单加氧酶基因(ammonia monooxygenase，AMO)的氨基酸序列如序列编号3所示，基因工程好氧硝化细菌 表达的氨羟胺氧化酶(Hydroxylamine oxidase,HAO)的氨基酸序列如序列编号4 所示。
所述基因工程硝化菌的氨单加氧酶基因前带有分泌型信号肽，其中信号肽的 氨基酸序列如编号5所示。
上述任一所述的基因工程硝化菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)利用细菌分离技术分离具有氨氮去除效果的硝化细菌基因组;
(2)利用PCR技术克隆氨单加氧酶基因和羟胺氧化酶，与pSIM6载体连 接后重组至步骤(1)的好氧硝化细菌基因组的特定位点中;
(3)利用基因工程技术从步骤(2)的产物中筛选出表达氨单加氧酶和羟胺 氧化酶基因的好氧硝化细菌;
(4)将步骤(3)的产物在高浓度氨氮条件下驯化，得到具有处理高浓度氨 氮污水能力的基因工程好氧硝化细菌;
(5)利用发酵技术将步骤(4)所述具有处理高浓度氨氮污水能力的基因工 程硝化细菌进行扩增，得到所述基因工程好氧硝化细菌。
上述任一所述的基因工程硝化菌的应用，将膜生物反应系统与所述基因工程 硝化菌联合，在高浓度氨氮条件下，有效去除污水中的高浓度氨氮;
所述膜生物反应系统为流动的需氧膜生物反应系统，膜的材质为树脂;
所述高浓度氨氮在所述污水中的氨氮含量是3000～6000mg/L。
所述污水中COD的去除率为98.44～99.84%。
所述污水中氨氮去除率为98.86～99.94%。
所述污水包括生活污水、工业废水、垃圾渗滤液以及高浓度氨氮废水等。
本发明通过应用基因工程操作技术，获得了具有高效去除污水中高浓度氨氮 的基因工程硝化细菌。实验表明表的达外源基因重组到细菌基因组中，没有影响 硝化细菌的增值。高浓度氨氮污水处理实验研究结果表明，重组硝化细菌可以有 效去除工业废水、垃圾渗滤液中的高浓度氨氮，达到国家要求出水标准。说明表 达功能基因的重组硝化细菌可作为理想高浓度氨氮去除菌剂。
