申请日2014.04.30
公开(公告)日2014.07.16
IPC分类号C12R1/38; C02F101/38; C12R1/01; C02F3/34; C12N1/20
摘要
本发明公开了一种混合菌群微生物制剂，是由类芽孢杆菌、施氏假单胞菌、假产碱假单胞菌和食油假单胞菌组成的菌悬液，其中，类芽胞杆菌活菌数为1.69×1010CFU/ml以上，施氏假单胞菌活菌数为2.35×1010CFU/ml以上，假产碱假单胞菌活菌数为2.18×1010CFU/ml以上，食油假单胞菌活菌数为2.26×1010CFU/ml以上。所述混合菌群微生物制剂可以用于处理含硝态氮废水，具体的应用方法为：调整含硝态氮废水的pH值至7.0～7.2，然后将混合菌群微生物制剂以1%～10%的接种量接种到含硝态氮废水中，30～35℃静置培养，培养4天后脱氮效果明显，可实现完全脱氮。
权利要求书
1.一种混合菌群微生物制剂，其特征在于：是由类芽孢杆菌、施氏假单胞菌、假产碱假 单胞菌和食油假单胞菌组成的菌悬液，其中，类芽胞杆菌活菌数为1.69×1010CFU/ml以上， 施氏假单胞菌活菌数为2.35×1010CFU/ml以上，假产碱假单胞菌活菌数为2.18×1010CFU/ml以上，食油假单胞菌活菌数为2.26×1010CFU/ml以上。
2.根据权利要求1所述的混合菌群微生物制剂，其特征在于：
所述类芽孢杆菌选自保藏编号为CCTCC NO：M2011120的菌种，该菌种分类命名为： Paenibacillus sp.XP1，保藏日期为2011年4月10日，保藏单位为：中国典型培养物保藏 中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编430072;
所述施氏假单胞菌选自保藏编号为CCTCC NO：M2011431的菌种，该菌种分类命名为 Pseudomonas stutzeri XP2，保藏日期为2011年11月27日，保藏单位为：中国典型培养物 保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编430072;
所述假产碱假单胞菌选自保藏编号为CCTCC NO：M2012225的菌种，该菌种分类命名为 Pseudomonas pseudoalcaligenes CL-1，保藏日期为2012年6月13日，保藏单位为：中国 典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编430072;
所述食油假单胞菌选自保藏编号为CCTCC NO：M2012226的菌种，该菌种分类命名为 Pseudomonas oleovorans CL-3，保藏日期为2012年6月13日，保藏单位为：中国典型培养 物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编430072。
3.权利要求1或2所述的混合菌群微生物制剂的制备方法，其特征在于：用平板划线活 化类芽孢杆菌1～3天;活化后，挑取单菌落接种于种子培养液中，30～35℃，150～180r/min， 摇床震荡培养18～24h，获得种子液;取种子液接种于富集培养液中，30～35℃，150～180 r/min，摇床震荡培养18～24h，获得富集培养菌液;富集培养菌液在5000～8000r/min下 离心15～20min，去上清液获得浓缩的菌体细胞，用无菌水稀释成1.5g湿菌体/L的菌悬液， 得类芽孢杆菌菌悬液;同样的方法制备得到施氏假单胞菌菌悬液、假产碱假单胞菌菌悬液和 食油假单胞菌菌悬液;将四种菌悬液等体积量混合，混匀，即得混合菌群微生物制剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
所述种子培养液为LB培养液;
所述富集培养液的组成为：酒石酸钾钠2%;KNO30.2%;K2HPO40.05%;MgSO4·7H2O0.02%; 余量为水;pH值7.0～7.2。制备时，将各组分混合混匀，调节pH值至7.0～7.2，110℃高 压灭菌20min，即得。
5.权利要求1或2所述的混合菌群微生物制剂在处理含硝态氮废水中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：具体应用方法为：调整含硝态氮废水的pH 值至7.0～7.2，然后将混合菌群微生物制剂以1%～10%的接种量接种到含硝态氮废水中，30～ 35℃静置培养。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：静置培养8～96小时。
说明书
混合菌群微生物制剂及其在处理含硝态氮废水中的应用
技术领域
本发明涉及一种混合菌群微生物制剂，及其在处理含硝态氮废水中的应用，属于环保技 术领域。
背景技术
目前，随着国民经济的不断发展，我国水体中氮的污染越来越严重，水体富营养化问题 突出，水资源紧缺、水环境日趋恶化己经成为制约我国经济发展的重要因素。我国大多数地 区的地下水在不同程度上遭受到硝态氮污染。水体中过量的硝酸盐对人体的健康危害极大， 在人体内，硝态氮会在微生物作用下被还原成亚硝酸盐，引起高铁血红蛋白症及婴儿青紫症。 另外硝酸盐和亚硝酸盐在一定条件下会转化成亚硝胺和亚硝酰胺，它们是高度致癌、致变、 致畸的物质，因此水体的防治及治理迫在眉睫。我国饮用水标准规定，硝酸盐氮含量必须低 于10mg/L。目前处理水体中硝态氮的方法有多种，主要分为物理化学法和生物反硝化法。 生物反硝化法与物理化学法相比，具有低能、高效、无二次污染的特点。反硝化反应发生在 缺氧或厌氧条件下，通过异养菌以NO2-和NO3-作为电子受体，将其还原成气态物质排出，从而 使氮循环顺利进行，从而降低由于硝酸盐和亚硝酸盐积累对生物造成的有毒侵害，对水质保 护有着重要的意义。
研究表明，反硝化微生物广泛存在于土壤、层积岩和水生态环境中，但在分类学上并没 有固定的分布。到目前为止，已经在50个属的150个种中检测到有反硝化能力的微生物，包 括细菌、放线菌、古生菌和真菌，并且反硝化微生物的范围还在不断扩大。其中假单胞菌属 (Pseudomonas)、奈瑟菌属(Neisseria)和芽胞杆菌属(Bacillus)是较为常见的反硝化细 菌，并且其反硝化过程均在厌氧和半厌氧条件下发生。假单胞菌属含有反硝化中的全部酶系， 能将NO3-还原成N2。芽胞杆菌属可利用NO3-或NO2-作为电子受体。
目前已经有研究从废水中分离鉴定反硝化微生物如Achromobacter，Alcaligenes， Aquaspirillum，Azoarcus，Bacillus，Brachymonas，Paracoccus，Pseudomonas，Rhodocyclus， Thauera等，在混合培养的条件下能成功的进行反硝化作用。
发明内容
针对上述现有技术，结合我国水污染现状以及发明人所在实验室前期从湿地植物根际土 壤及活性污泥中分离的反硝化菌株，本发明提供了一种混合菌群微生物制剂，及其在处理含 硝态氮废水中的应用，以及具体的应用方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种混合菌群微生物制剂，是由类芽孢杆菌、施氏假单胞菌、假产碱假单胞菌和食油假 单胞菌组成的菌悬液，其中，类芽胞杆菌活菌数为1.69×1010CFU/ml以上，施氏假单胞菌 活菌数为2.35×1010CFU/ml以上，假产碱假单胞菌活菌数为2.18×1010CFU/ml以上，食 油假单胞菌活菌数为2.26×1010CFU/ml以上。
进一步地，所述类芽孢杆菌选自保藏编号为CCTCC NO：M2011120的菌种，该菌种分类 命名为：Paenibacillus sp.XP1，保藏日期为2011年4月10日，保藏单位为：中国典型培 养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编430072。记载在申请人的另一项中 国专利中，专利号201110121394.2，公开号102220265A。
进一步地，所述施氏假单胞菌选自保藏编号为CCTCC NO：M2011431的菌种，该菌种分 类命名为Pseudomonas stutzeri XP2，保藏日期为2011年11月27日，保藏单位为：中国 典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编430072。记载在申请人的另 一项中国专利申请中，专利申请号201210201671.5，公开号102899263A。
进一步地，所述假产碱假单胞菌选自保藏编号为CCTCC NO：M2012225的菌种，该菌种 分类命名为Pseudomonas pseudoalcaligenes CL-1，保藏日期为2012年6月13日，保藏单 位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编430072。记载在 申请人的另一项中国专利申请中，专利申请号201310032730.5，公开号103114062A。
进一步地，所述食油假单胞菌选自保藏编号为CCTCC NO：M2012226的菌种，该菌种分 类命名为Pseudomonas oleovorans CL-3，保藏日期为2012年6月13日，保藏单位为：中 国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编430072。记载在申请人的 另一项中国专利中，专利号201210269891.1，公开号102776145A。
所述混合菌群微生物制剂的制备方法，如下：
用平板划线活化类芽孢杆菌1～3天;活化后，挑取单菌落接种于种子培养液中，30～35 ℃，150～180r/min，摇床震荡培养18～24h，获得种子液;取种子液接种于富集培养液(接 种量为15～20%，体积百分数)中，30～35℃，150～180r/min，摇床震荡培养18～24h，获 得富集培养菌液;富集培养菌液在5000～8000r/min下离心15～20min，去上清液获得浓 缩的菌体细胞，用无菌水稀释成1.5g湿菌体/L的菌悬液，得类芽孢杆菌菌悬液;同样的方 法(步骤、参数、培养基均相同)制备得到施氏假单胞菌菌悬液、假产碱假单胞菌菌悬液和 食油假单胞菌菌悬液;将四种菌悬液等体积量混合，混匀，即得混合菌群微生物制剂。
所述平板划线活化时所用的培养基为LB培养基，为现有技术中已有的常规培养基。
所述种子培养液为LB培养液，为现有技术中已有的常规培养基。
所述富集培养液的组成为(下述各组分的百分数的单位为g/ml)：酒石酸钾钠2%;KNO30.2%;K2HPO40.05%;MgSO4·7H2O0.02%;余量为水;pH值7.0～7.2。制备时，将各组分混合 混匀，调节pH值至7.0～7.2(氢氧化钠溶液或盐酸调节)，110℃高压灭菌20min，即得。
所述混合菌群微生物制剂，可以用于处理含硝态氮废水，具体的应用方法为：调整含硝 态氮废水的pH值至7.0～7.2(用氢氧化钠溶液或盐酸调整)，然后将本发明的混合菌群微生 物制剂以1%～10%(体积百分数)的接种量接种到含硝态氮废水中，30～35℃静置培养。
优选的，静置培养8～96小时，最优选的，静置培养96小时(4天)，脱氮效果明显。
本发明的发明人经反复研究和实践发现，利用类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、施氏 假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes) 和食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)组成的混合菌群微生物制剂来处理含硝态氮废 水，可实现氮的高效去除。本发明的成果可应用于工业废水处理中的生物脱氮工艺，同时对 各种环境的NO3-/NO2-修复以及水体的富营养化污染防治也具有广泛的应用前景。
