氧化石墨烯( GO) 是石墨烯基纳米材料中较为典型的一种，其优异的性质在新能源、电子信息、生物医药、环境保护等领域都有巨大的应用潜力。然而GO 在生产、运输、使用和废弃过程中将会不可避免地进入到城市污水处理系统，目前城市污水处理系统主要依赖于操作简便的活性污泥法，因此，探究GO 对活性污泥及污水处理效果的影响至关重要。
GO 的抗菌性已被广泛证实，研究表明，其对细菌的毒性作用主要表现为对细胞膜的破坏以及氧化胁迫作用，所以，GO 对活性污泥微生物也必然存在一定的影响。现有关于 GO 细菌毒性的研究大多针对单一菌种，对活性污泥系统中微生物的毒性研究主要集中于高浓度的短期暴露影响，与现实情况中的低浓度、长期暴露环境区别较大。因此，探究GO长期暴露对SBR 性能和微生物群落结构的影响能为污水厂处理石墨烯基纳米材料污染物提供科学依据，进而更加有效地处理各类突发情况。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
实验用水为人工配制的模拟生活污水。模拟废水组成: CH3COONa ( 512 mg / L) 、NH3Cl( 100mg / L) 、KH2 PO4 ﹒ H2O( 60mg / L) 及浓缩微量元素液; 实验废水的水质指标为 COD 400 mg / L，氨氮( NH4 N) 25 mg / L，总磷( TP) 10 mg / L，pH 为7.0 ～7.5。微量元素包括: MgSO4 ·7H2 O( 5. 07 mg / L) ，MnSO4 ·4H2 O( 0. 31 mg /L) ，FeSO4·7H2 O( 2. 49 mg / L) ，CuSO4( 0. 25 mg / L) ，Na2 MoO4 ·2H2 O( 1. 26 mg / L) ，ZnSO4 ·7H2 O( 0. 44mg / L) ，NaCl( 0. 25 mg / L) ，CaSO4 ·2H2 O ( 0. 43 mg / L) ，CoCl2 ·6H2 O( 0. 41 mg / L) ，EDTA( 1. 88 mg / L) 。实验所用仪器为: 磁力加热搅拌器、电磁式空气泵、蠕动泵、电热鼓风干燥箱、电子天平、超声波清洗器、扫描电镜、紫外分光光度计、pH 计、电子万用炉。接种污泥取自长春市北郊污水处理厂好氧池活性污泥。
1.2 实验装置
实验装置为 4 个SBR 反应器，外径 11cm，内径10cm，有效容积2L，排水体积 1L。反应器设有进水口、出水口、排泥口、曝气头和搅拌器。调节温度为 22℃ ±3℃ 、pH 值为7.6 ～8.0、溶解氧为3 ～3.5mg / L。SBR 反应器运行周期为8h，进水10min，厌氧搅拌120 min，曝气210min，静置沉降130min，出水10min。实验装置示意图如图 1 所示。
1－曝气泵; 2－气体流量计; 3－曝气头; 4－磁力搅拌器; 5－进水口; 6－出水口; 7－排泥口; 8－蠕动泵; 9－进水箱
图 1 实验装置示意图
1.3 实验过程及采样
反应器运行45d，在实验开始前对活性污泥进行驯化，在脱氮除磷性能稳定后开始实验。在4 个反应器中加入GO，使反应器中 GO 浓度为 0mg / L、1mg / L、5mg / L、10mg / L。根据出水和排泥所损失的GO 量，每天添加一定量的GO。反应器每天运行3 个周期，每2d 选取固定时间对各反应器出水取样。
1.4 水质指标分析方法
各反应器出水用0.45 um 的水系滤膜滤后的NH4 N、TN、TP 均采用国家标准方法测定。COD、PH、DO均采用哈纳检测仪进行检测。
1.5 高通量测序方法
本文中污泥样品的测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司完成。根据 E.Z.N.A. soil 试剂盒 ( O- mega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.) 说明书进行总DNA 抽提，DNA 浓度和纯度利用NanoDrop2000 进行检测，利用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 提取质量; 用 338F( 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3’) 和806R( 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) 引物对 V3 - V4 可变区进行 PCR 扩增。利用 Illumina 公司的 MiseqPE300 平台进行测序。原始测序序列使用 Trimmomatic 软件质控，使用FLASH 软件进行拼接。使用的UP-ARSE 软件( version 7.1) ，根据 97%的相似度对序列进行OTU 聚类; 使用UCHIME 软件剔除嵌合体。具体联系污水宝或参见http://www.dowater.com更多相关技术文档。
2 结果与讨论
2.1 GO 对 SBR 系统性能的长期影响
各反应器出水中COD 浓度如图2 所示。进水 COD 约为 400mg / L，在45d 的运行时间里，控制组的 COD 平均去除率达到95.1%。1mg / L GO 对COD 的去除影响并不明显; 在 11d 时，5mg / L GO 组的出水 COD 上升到 42mg / L，去除率下降到 89.5%; 在21d 时，出水COD 达到最高，浓度为 67mg / L，去除率下降到 83.3%; 21d 后，出水COD 浓度有所下降，但平均去除率仍在89% 以下。10mg / L GO组的出水COD 高于控制组，最高时达到43mg / L，去除率为89. 3%。
图 2 GO 对 COD 去除的影响
分析结果可知，5mg / L GO 与 10mg / L GO 均对 SBR系统的 COD 去除率产生了抑制，5mg / LGO 对 COD 去除的抑制作用更强。污水生物处理去除COD 主要是通过污泥微生物的生产代谢对污水中的有机物进行利用，除此之外，还有可能被菌胶团等物质吸附后随剩余污泥排出。因此，10mg / L GO 对去除 COD 的抑制效果低于 5mg / L GO 的原因可能是GO 对反应器中的有机物产生了更好的吸附，一定程度上降低了 COD。但显而易见的是，GO 对活性污泥微生物产生了一定的毒性，并且能够降低有机物的去除效率。
4 个反应器中出水氨氮的浓度如图 3 所示。进水氨氮约为25mg / L，控制组的氨氮浓度去除率达到95. 1%，1mg / L GO 组的出水氨氮浓度与控制组的区别不大，在23d 后略高于控制组。5mg / L GO 与10mg / LGO 对氨氮的去除有明显的抑制，在29d 前，10mg / L GO 的出水氨氮浓度高于5mg / LGO 组，随后氨氮浓度有所下降并趋于平稳，而5mg / L GO 在29d 后的氨氮浓度高于10mg / L GO。在出水氨氮趋于平稳后，5mg / LGO 组的氨氮平均去除率下降到70.5%，10mg / L GO 组的平均去除率为70.2%。
通过实验结果推断，GO 能够抑制硝化细菌的活性，削弱其将氨氮转化为亚硝态氮的能力。其原因可能是由于GO 的存在，使得硝化细菌生长速率降低，从而抑制硝化作用。
图 3 GO 对氨氮去除的影响
各反应器总氮浓度如图 4 所示。为期45d 的实验期间，控制组与1mg / L GO 组的总氮去除率区别不大，平均去除率分别为 84.1%和 83.4%。实验开始后，5mg / LGO 组与10mg / LGO 组的出水总氮浓度逐渐上升，并在17d 左右开始趋于稳定，且10mg / LGO 对总氮去除的抑制程度高于5mg / LGO。二者在45d 内的总氮平均去除率分别下降至60.3%和54.1%。这一结果说明，GO 对脱氮细菌的生物活性存在抑制作用。
图 4 GO 对总氮去除的影响
4 个反应器中出水 TP 浓度如图 5 所示，进水 TP 约为 10mg / L，控制组与 1mg / L GO 组的总磷去除率均在 90%以上，说明低浓度 GO 对总磷的去除并无显著影响。5mg / L GO 组的出水 TP 浓度最高达到 7. 11mg /L，去除率下降 28.9%，10mg / L GO 组的出水 TP 浓度最高达到 5.98mg / L，去除率为 40.2%。由数据可知，GO长期暴露后，5mg / L GO 对总磷去除的抑制程度要略高于 10mg / L GO。GO 对除磷效率的抑制可能是由于其对活性污泥中除磷相关细菌活性的抑制，也有可能是由于微生物细胞因 GO 的毒性而破裂，使内容物外泄从而导致总磷升高。
图 5 GO 对总磷去除的影响
2.2 微生物群落多样性分析
可以通过单样本的多样性( Alpha 多样性) 分析来反映微生物群落的丰富度和多样性，包括通过一系列统计学分析指数来估计环境群落的物种丰度和多样性。OTU( Operational Taxonomic Units) 是为了便于分析，人为给某一个分类单元( 品系，属，种、分组等) 设置的统一标志，再通过聚类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。反映群落丰富度的指数有sobs、chao、ace 等; 反映群落多样性的指数有 shannon、simpson、npshannon 等; 反映群落覆盖度的指数为coverage。
本文列举了具有代表性的 OUT、shannon、simpson、coverage、chao 指数。shannon 指数越大，simpson 指数越小，说明样品生物多样性越高; Chao 指数越高，表明群落丰度越高; coverage 数值越高，则样本中序列被测出的概率越高。如表 1 所示，GO 短期暴露的4 个样品中，5mg / L GO 的 OTU 数量最低，而1mg / L GO 与 10mg / L GO 的OTU 数与空白组相差不大。短期暴露的 4 组样品中，5mg / L GO 的多样性最低，物种丰度也较其他 3 组更低。而1mg / L GO 的多样性比空白组更高，可能是由于低浓度 GO 对微生物有促进作用。
长期暴露的4 组样品多样性与物种丰度普遍低于短期暴露的样品，其原因可能是实验室的配水与实际污水相比过于单一。但不同浓度的 GO 仍然对活性污泥的多样性产生了不同的影响。与短期暴露时相同，5mg / L 的 OTU 数最低( 776) ，比空白组( 992) 降低了约 20%，1mg / L GO( 791) 与10mg / L GO( 794) 的 OTU 数也都低于空白组。4 组样品中，5mg / L GO 的 shannon、chao 指数最低，simpson 指数最高，物种多样性与群落丰度最低。总的来说，5mg / L GO 对物种多样性的负面影响最大，而1mg / L GO 在短期暴露时会增加物种多样性。
如图 6 为污泥样品在门水平的细菌丰度分布图。由图 6 可知，变形菌门( Proteobacteria) 、拟杆菌门 ( Bacteriodetes) 、放线菌门( Actinobacteria) 绿湾菌门( Chloroflexi) 为 4 种优势菌群。其中，变形菌门的含量占总菌数的 43.2% ～ 67.5%，在所有样本中处于绝对优势。说明变形菌门的变形菌门细菌能够很好地去除废水中有机物，是污水处理厂常见的菌种，且均为革兰氏阴性菌。长期暴露的样品与短期暴露相比，变形菌门的比例均有提升，而长期暴露的5mg / L GO 污泥样品中，变形菌门的比例最高，达到了 67.5%。
拟杆菌门在长期暴露时也受到较大的的影响，拟杆菌门能促进含氮物质的利用、转化类固醇生物和水解大分子物质，对生物脱氮过程起到重要作用，是专性厌氧微生物。GO 长期暴露后，拟杆菌门的相对丰度有不同程度的上升，其中，10mg / LGO 的拟杆菌丰度上升最高，达到34.5%。
GO 长期暴露的样品中放线菌门与绿湾菌门的相对丰度普遍低于短期暴露的样品。长期暴露的 4 个样品中，放线菌门相对丰度的下降幅度更为明显，而绿湾菌门的相对丰度随 GO 浓度的增加而下降。
图 6 门水平微生物群落分布
从暴露时间角度考虑，GO 短期暴露与长期暴露对污泥样品门水平的菌群丰度分布会产生不同的影响，长期暴露会增加变形菌门与拟杆菌门的丰度，降低拟杆菌门与放线菌门的丰度。从暴露浓度角度考虑，暴露45d 时，5mg / L GO 对变形菌门细菌促进作如图 7 所示。污泥样品在属水平上共检测出 47 个属，优势菌属有Cytophagaceae、Thiothrix、Xanthomonadaceae、Acinetobacter、Candidatus Competibacter、Anaerolineaceae、Saprospi-raceae、Nitrosomonadaceae、Comamonadaceae、Nitrospira、Zoogloea、Saprospiraceae 等。Cytophagaceae 具有脱氮除磷的功能，是污泥样品中最优势的菌属。暴露45d 时，5mg / LGO 的 Cytophagaceae 菌属丰度下降较为明显，这可能是由于丝硫菌属( Thiothrix) 在竞争中形成了较大优势，对 Cytophagaceae 菌产生了抑制。丝硫菌是引发污泥膨胀的主要菌属，5mg / LGO 样品中丝硫菌丰度上升了23.3%，这也解释了长期暴露时反应器的污泥沉降性下降的原因。Xanthomonadaceae 细菌具有脱氮功能，经过 GO 长期暴露后，其相对丰度由空白组的7. 5%降到了4.6%，且GO 浓度越高下降幅度越大，这也可能是导致反应器脱氮能力降低的原因。Nitrospira是典型的亚硝化细菌，Thauera 菌具有反硝化作用，这两种菌在长期暴露后的相对丰度也都下降到1% 以下。
Tetrasphaera 是除磷菌，该菌也在长期暴露后丰度明显减少。Anaerolineaceae 具有反硝化功能，经GO长期暴露后丰度有一定程度的上升。
3 结论
( 1) 1mg / LGO 对各水质指标没有明显影响，5mg / L GO 与10mg / LGO 则对 COD、NH4 + - N、TN、TP 都有不同程度的抑制作用，其中，5mg / LGO 对出水水质的影响大于10mg / L GO; 而GO对磷去除的抑制作用最
图 7 属水平微生物群落分布
强，GO 浓度为 5mg / L 时，去除率最低时下降到 28.9%。
( 2) 结果表明，高浓度 GO 会明显降低微生物群落的丰富度和多样性，其中，5mg / L GO 的影响大于 10mg / L GO，1mg / L GO 在短期暴露时能够提升物种多样性。GO 长期暴露后变形菌门与拟杆菌门的种群丰度有明显提升; 5mg / L GO 样品中丝硫菌( Thiothrix) 丰度上升到 23.3%，这解释了污泥膨胀及沉降性变差的原因; Xanthomonadaceae、Nitrospira、Thauera 等与脱氮有关的功能性菌属在高浓度 GO 暴露后丰度有明显下降，这解释了 SBR 反应器脱氮能力下降的原因; 除磷菌( Tetrasphaera) 在 GO 长期暴露后丰度也有所下降，这也对应了 GO 对 SBR 反应器除磷能力的抑制。(来源：东北师范大学 环境学院)
