申请日2014.03.19
公开(公告)日2014.05.28
IPC分类号G01N1/28; G01N27/62
摘要
鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，它涉及一种鉴定ANAMMOX反应器污泥中微生物是否利用有机物的方法。本发明提供一种不用富集高纯度ANAMMOX菌，无需分离、鉴定、纯化，不必纯培养，便可以鉴定ANAMMOX反应器中污泥内的ANAMMOX菌是否可以利用有机物的方法。鉴定方法：一、用15N标记ANAMMOX反应器内的氨氮，用13C标记ANAMMOX反应器内的有机物，然后厌氧氨氧化反应;二、TEM观察;三、制备导电样品;四、根据NanoSIMS图片进行得出结果。本发明应用于水处理及微生物领域。
权利要求书
1.鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在 于鉴定方法按以下步骤进行：
一、用15N标记ANAMMOX反应器内的游离态氨，用13C标记ANAMMOX反应器内的 有机物，然后厌氧氨氧化反应10～100小时，之后终止反应，离心分离获得微生物样品，将微 生物样品放置于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中固定;
二、用步骤一微生物样品制备透射电子显微镜样品，然后进行TEM观察;
三、根据步骤二TEM观察结果选择目标微生物分布均匀的位置，利用切片机切片成半薄 切片，放置于导电硅片上，经固定、烘干后再次喷金覆盖，得到导电样品;
四、利用纳米二次离子质谱技术扫描步骤三制备的导电样品中的标记元素，获得 NanoSIMS图片;若15N标记富集的区域中有13C明显富集，则该反应器内的ANAMMOX菌 可以利用有机物;若15N标记富集的区域中没有13C富集，则该反应器内的ANAMMOX菌不 能利用有机物。
2.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有 机物的方法，其特征在于步骤二透射电子显微镜样品按以下步骤制备：
A、从2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中取出样品，然后用0.1mol/L磷酸漂洗液漂洗三次，再 用1%锇酸固定液固定2～3小时，而后用0.1mol/L磷酸漂洗液漂洗三次，每次15分钟;再在 4℃条件下用梯度浓度为50%、70%、90%、95%的乙醇溶液对样品依次进行脱水处理，每种 浓度处理15分钟;之后再用乙醇丙酮混合液和90%的丙酮溶液分别脱水三次，每次15～20min， 然后在室温下放入浓度为100%的丙酮中脱水三次，每次15～20min;
B、用纯丙酮与包埋液的混合液对步骤A处理后的样品室温处理3～4小时，然后37℃下 纯包埋液包埋2～3小时、60℃固化5小时、再80℃固化24小时;
C、切片;
D、用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色切片，即完成透射电子显微镜样品;
步骤A中乙醇丙酮混合液由浓度为90%的乙醇和浓度为90%的丙酮按1:1的体积比混合 而成;
步骤B纯丙酮与包埋液的混合液中纯丙酮与包埋液的体积比为2:1。
3.根据权利要求2所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有 机物的方法，其特征在于步骤C中切片厚度为50～60nm。
4.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有 机物的方法，其特征在于步骤三中半薄切片的厚度为500～1000nm。
5.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有 机物的方法，其特征在于步骤三中导电硅片为喷金的玻璃片。
6.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有 机物的方法，其特征在于步骤三中喷金覆盖厚度为8～12nm。
7.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有 机物的方法，其特征在于步骤一中厌氧氨氧化反应时间为10～50小时。
8.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有 机物的方法，其特征在于步骤一中厌氧氨氧化反应时间为15～30小时。
9.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有 机物的方法，其特征在于步骤一中厌氧氨氧化反应时间为20小时。
10.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用 有机物的方法，其特征在于步骤一中用13C标记的有机物为甲酸、乙酸、丙酸、丙酮、苯或 其衍生物。
说明书
鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法
技术领域
本发明涉及一种鉴定ANAMMOX反应器污泥中微生物是否利用有机物的方法。
背景技术
随着全球工业化、城市化的发展，人口的快速增长，用水量大大增加，水资源的日益紧 缺正威胁着人类的生存与发展。我国是严重缺水国家之一，淡水量仅占世界平均的1/4，并且 已进入水资源危机初期，同时水源地域分布的不平衡，使淡水短缺矛盾更加突出。更为严峻 的问题是我国水资源污染较严重，从一般污染物扩展到有毒有害污染物，已经形成了点源与 面源共存，生活污染和工业排放叠加，各种新旧污染和二次污染相互复合的态势。同时，城 市人口的膨胀给有限的给水系统和排水设施造成巨大的压力，污水处理设施总量不足，也导 致一部分污水未经处理直接排放到自然水体中。因此，控制和治理我国水环境污染成为迫切 需要解决的问题，除了需要控制污染，减少污染源外，更重要的是加快提高污水处理效率极 其资源化程度。
根据《中国环境状况公报》，2001年到2012年我国废水排放总量逐年提高，从2001年 的432.9亿吨增加到684.6亿吨(其中氨氮总排放量为253.6万吨，工业排放量为26.4万吨， 生活排放量为144.7万吨)，其中生活污水所占比例逐年提高。生活污水是城市污水的主要组 成部分，而且是氨氮污染物的主要来源。含氮污染物会造成水体富营养化;影响给水源水水 质，增加给水处理成本，而且化合态氮对人体和生物具有毒害作用。早在2003年，我国正式 实施了《城镇污水处理厂污染物排放标准》根据二级强化处理的技术水平，增加对总氮控制。 2008年，国家环保部、国家质监总局先后出台了7个行业共计12个污染物排放标准。新标 准新增了控制项目，分年限对各行业不同工艺制定了污染物控制项目和标准限值。水污染物 也增加了总磷、总氮等基本项目。
随着公众环境意识的提高和国家对氮、磷排放限制标准的日趋严格，传统污水生物处理 工艺日益显示出一些自身无法克服的缺点，例如流程长，基建费用高，操作麻烦;需要曝气， 能源消耗大;需要控制碳氮比，或投加额外碳源;释放二氧化碳等等。因此，如何经济并有 效地去除污水中的含N、P的化合物，有效地保护受纳水体，进而防治水体的富营养化，成 为迫切需要解决的问题。
ANAMMOX(厌氧氨氧化)工艺是目前已知的最经济的生物脱氮技术，与传统的硝化反 硝化技术相比，ANAMMOX工艺具有能耗低、不消耗有机碳、剩余污泥量小、不释放CO2 等优点，在生物脱氮领域具有广泛的应用前景。
ANAMMOX菌是一种化能自养型细菌，以无机碳为碳源，之前认为不能利用有机碳。由 于受无机物氧化产生能量不足的制约，ANAMMOX微生物存在生长缓慢、世代时间长、细胞 得率低等诸多缺陷，导致细菌培养周期长，导致其实际应用效率被限制。
如能证明ANAMMOX菌可利用有机物，则可以通过人为调节水体中有机物的方式大大 缩短ANAMMOX微生物的生长周期和世代，提高细胞得率和脱氮效果。但是研究ANAMMOX 菌20余年，至今ANAMMOX污泥中的ANAMMOX微生物仍未获得纯培养，为生理生化研 究造成了巨大的困难。虽经研究人员的不懈努力、采用多种方法截至2011年一共从厌氧氨氧 化反应器污泥中分离、鉴定出了8株ANAMMOX菌，但鉴定结果显示这些ANAMMOX菌 分属于不同的种属，而且分别出现在不同的ANAMMOX污泥中。由于ANAMMOX污泥的 来源不同，组成ANAMMOX污泥的微生物也不同，所以不同ANAMMOX污泥的生理生化 特点也不相同。尽管利用同位素示踪技术已经证明已知的ANAMMOX菌中某些特定菌株可 以利用有机物，但是依靠分离、鉴定的方式无法满足对不同ANAMMOX污泥中ANAMMOX 菌研究的需要。
另有研究人员通过富集的手段对ANAMMOX污泥中ANAMMOX菌的生理生化进行研 究，但富集的微生物中还包含有非ANAMMOX菌，因此其实验结果会受到非ANAMMOX 菌的干扰，而且富集过程中也可能导致微生物种群发生变化，影响结果的准确性。
由于ANAMMOX菌没有获得纯培养，所以ANAMMOX菌利用有机物的研究都是建立 在反应器水平上的，作为一个混合培养体系，仅能证明有机物对ANAMMOX过程无影响， 其结果均通过水体中物质的浓度变化分析间接得出的，不能为ANAMMOX菌利用有机物提 供直接证据;而且无法获知利用有机物的是富集物中的哪种或哪些微生物。即使对污泥中的 ANAMMOX菌富集培养并采用现有的同位素示踪技术，由于未能实现纯培养，微生物中的干 扰因素未能排除，其实验结果仍然缺乏可信度和说服力。
发明内容
本发明要提供一种不用富集高纯度ANAMMOX菌，无需分离、鉴定、纯化，不必纯培 养，便可以鉴定ANAMMOX反应器中污泥内的ANAMMOX菌是否可以利用有机物的方法。
本发明鉴定方法按以下步骤进行：
一、用15N标记ANAMMOX反应器内的游离态氨，用13C标记ANAMMOX反应器内的 有机物，然后厌氧氨氧化反应10～100小时，之后终止反应，离心分离获得微生物样品，将微 生物样品放置于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中固定;
二、用步骤一微生物样品制备透射电子显微镜样品，然后进行TEM观察;
三、根据步骤二TEM观察结果选择目标微生物分布均匀的位置，利用切片机切片成半薄 切片，放置于导电硅片上，经固定、烘干后再次喷金覆盖，得到导电样品;
四、利用纳米二次离子质谱技术扫描步骤三制备的导电样品中的标记元素，获得 NanoSIMS图片;若15N标记富集的区域中有13C明显富集，则该反应器内的ANAMMOX菌 可以利用有机物;若15N标记富集的区域中没有13C富集，则该反应器内的ANAMMOX菌不 能利用有机物。
本发明方法为反应器内污泥中的ANAMMOX菌是否可以利用有机物提供了直接证据。 本发明方法不改变微生物的生存环境，保证了ANAMMOX微生物的原有种群和丰度，不受 反应器的影响，并排除了非ANAMMOX菌的干扰，具有准确、可靠的特点;而且为ANAMMOX 菌的后期研究和发展奠定了基础。
