滨海河口区受潮汐作用影响，水体多为咸水或半咸水，经济发展导致水体富营养化现象普遍存在.近年来，生态浮床技术在水生态修复中得到广泛应用，生态浮床利用植物根系的吸附和吸收作用，能够有效地降低水体中污染物浓度，同时，浮床植物根系能够附着微生物，利用微生物的降解功能进一步提高生态浮床对水体的净化能力.有研究表明，在淡水环境中，植物根系分泌的有机酸、蛋白质等物质能够促进微生物的生长，根系泌氧为植物内生菌和根际微生物提供氧气;同时，微生物降解产生的小分子有机物、无机物等可以被植物吸收利用，植物和微生物产生协同增效作用，进一步强化生态浮床对水质的净化效果;然而目前将生态浮床应用于净化滨海地区盐碱水体的研究较少.受盐碱胁迫的影响，一方面，植物的生长受到限制，光合作用强度降低，根系活力下降，生态浮床对水体的净化效果尚不清楚;另一方面，在盐碱环境中，植物和微生物在净化富营养化水体中能否产生与淡水环境中相同的协同增效作用有待进一步探究.本研究选用盐生植物碱蓬(Suaeda salsa)作为浮床植物，在浮床上安装附着有微生物的人工介质，构建组合型浮床;通过对照实验，探究该组合型浮床对富营养化微盐碱水体的净化效果，对植物和微生物在水质净化过程中的协同增效作用进行探讨，并对浮床植物生长状况和微生物特征进行分析，以期为组合型浮床在微盐碱水体生态修复中的应用提供理论支撑.
1 材料与方法1.1 实验装置
实验在4个相同的反应器中进行，反应器长宽高为80 cm×20 cm×50 cm，反应区长70 cm，有效水深30 cm，反应器由进水系统、浮床系统、曝气系统和出水系统4部分组成，如图 1所示.其中，浮床系统由浮床植物、浮板和悬挂在浮板下的人工介质3部分组成.实验选取滨海盐生植物碱蓬作为浮床植物，选用聚乙烯泡沫板为浮板(50 cm×19 cm×2.5 cm)，浮板上带有直径为5 cm的植物种植孔，可以将植物固定在种植孔中;浮板下悬挂人工介质(醛化纤维)，每组悬挂六串，每串长25 cm;在反应区底部安装有曝气系统.
图 1 组合型浮床示意
1.2 实验材料
实验用水为自行配置的模拟水，各项指标均参考青岛市李村河河口区水质状况，如表 1，水体盐度为5‰~7‰，pH值为8.5~9.0.
表 1 实验用水水质指标
实验用植物碱蓬采自青岛市李村河河口区.实验开始前，先将碱蓬植株在Hoagland营养液中水培15 d，待长出新根后，选取长势良好且株高和根长相近的植株作为浮床植物，并清洗根部.称取200 g碱蓬植物种植于浮床的种植孔中，浮床植物平均株高19 cm，平均根长4.5 cm，平均种植密度500株·m-2.浮床所用人工介质在挂膜前进行消毒，选对植物具有抗病虫害、促进植物生长的枯草杆菌作为菌剂，采用闷曝法进行挂膜，挂膜3 d后，人工介质上出现淡黄色黏稠状生物膜后，安装于浮床上进行实验.
1.3 实验设计
本实验在编号为A、B、C、D的4个相同的反应器中进行，分别安装空白浮床A、植物浮床B、微生物浮床C、植物+微生物组合型浮床D. 4组实验进行统一供水，实验用水通过计量泵连续进入配水池，再通过布水隔板上的布水孔均匀地进入反应区，并从出水口(阀门2) 连续出水;调节进水流速，控制力停留时间(HRT)为4 d. 4组实验均连续曝气，调节曝气量为0.8 L·min-1.实验从2016年5月26日(0 d)开始，至2016年6月19日(24 d)结束，实验期间各组水温为15~18℃.采光良好，室内气温为18~25℃.
1.4 监测项目和测试方法
实验开始后，每天上午08:00从反应器出水口采集水样，迅速在实验室内进行分析，测定水样中的盐度、pH、氨氮、硝态氮、总氮、总磷的浓度和高锰酸盐指数.实验结束后，测定各组水体中的细菌总量.分别在各组实验开始时和结束时，测量每组碱蓬的鲜重、株高和根长.
水质指标监测按文献方法测定.其中，水体中的氨氮采用纳氏试剂分光光度法;硝态氮采用氨基磺酸紫外分光光度法;总氮采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法;总磷采用过硫酸钾消解-钼锑抗分光光度法;高锰酸盐指数的测定采用高锰酸钾法;水体中细菌总量采用平板涂布法.
1.5 高通量测序分析
在实验进行24 d时从反应器C、D中采集菌体样品，并采用CTAB对样本的基因组DNA进行提取，检测DNA的纯度和浓度，进行PCR扩增和产物纯化(委托北京诺禾致源公司完成).使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用HiSeq2500 PE250对细菌16S rDNA V4区进行测序(委托北京诺禾致源公司完成).
利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/)对所有样品的全部Effective Tags进行聚类，默认以97%的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs(operational taxonomic units)，同时会选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列.
选取每个样品在门水平(Phylum)上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度分布图.对不同样品在97%一致性阈值下的Alpha Diversity分析指数进行统计.
1.6 数据分析
为探究组合型浮床在净化富营养化微盐碱水体的过程中植物单元和微生物单元的作用，本研究在测定水体中各项污染物指标的基础上，用c/c0来表征出水污染物浓度变化，其中，c为出水污染物浓度(mg·L-1)，c0为进水污染物浓度(mg·L-1);分别计算各污染物的去除率η1，其他作用(曝气、光照等)去除率η2，植物单元去除率η3，微生物单元去除率η4，增效作用去除率η5，计算方法为：
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
对各组实验出水中污染物的各项指标进行初步分析表明，实验进行10 d后出水中各污染物浓度基本趋于稳定，因此选取第0、2、4、6、8、10、12、18、24 d的监测数据进行分析，并计算10~24 d的出水平均浓度.数据分析采用统计软件SPSS 19.0，通过单因素方差分析(ANOVA)比较各项测试指标在实验条件下的显著性差异，并在P=0.05水平下进行Tukey检验;采用主成分分析法对反应过程中各因素的主成分进行分析.数据作图采用Origin 8.5.
2 结果与讨论2.1 组合型浮床对氮的净化效果2.1.1 不同组合浮床对氮的净化效果
4组浮床进出水中氨氮、硝态氮、总氮的浓度变化如图 2(a)~2(c)所示.实验初期，各组实验出水中氨氮、总氮浓度均随时间的延长显著降低(P < 0.05)，10 d后4组实验出水中氨氮、总氮浓度逐渐趋于稳定;4组实验出水中硝态氮浓度出现不同的变化趋势，在0~4 d，水体中硝态氮浓度逐渐升高，其中添加有微生物的C组和D组实验出水中硝态氮浓度显著高于进水(P < 0.05);在4~12 d，4组实验出水中硝态氮浓度迅速降低，并趋于稳定.待出水稳定后，D组实验出水中氨氮、硝态氮、总氮平均浓度最低，出水平均浓度为0.83、0.91和1.82 mg·L-1，均达到地表Ⅴ类水质量标准.
图 2 不同组合浮床对氮的净化效果
2.1.2 植物和微生物对氮的净化作用
水体中的氮主要由氨氮、硝态氮、亚硝态氮和有机氮组成.水体中氮的去除机制主要有物理吸附作用、植物吸收和微生物降解作用.按照1.6节中污染物去除率的计算方法，得到组合型浮床净化氨氮、硝态氮和总氮的过程中其他作用去除率η2、植物单元去除率η3和微生物单元去除率η4，如图 2(d)所示.浮床D对氨氮的去除率η1为77.8%，其中η4(38.6%)>η2(24.9%)>η3(16.5%)，表明微生物在组合型浮床去除水体中氨氮的过程中发挥着主要作用.在有氧环境中，植物可以直接吸收利用氨氮合成多种氨基酸，而大部分的氨氮则主要通过硝化细菌的硝化作用转化为硝态氮和亚硝态氮，一部分被植物吸收利用，一部分被反硝化细菌转化为氮气排出水体.同时，在碱性环境下，一部分游离态的NH4+转化为分子态的NH3和NH3·H2O，在连续曝气作用下，通过挥发作用逐渐被去除.
水体中硝态氮的去除方式主要有两种，一是被植物根系吸收利用，作为植物生长所需营养，进入植物体内被转化为有机氮;二是在缺氧或厌氧环境中通过水体中反硝化细菌的硝化作用，转化为亚硝态氮，进而转化为N2进入到空气中.由图 2(b)可知，实验开始时，在添加有微生物的C组和D组实验出水中硝态氮浓度显著高于进水(P < 0.05)，主要是由于在实验初期植物和微生物的生长状态尚不稳定，植物对硝态氮的吸收速率小于微生物的硝化作用速率，水体中的硝态氮不断积累;随着实验的进行，一方面，浮床植物生长状态趋于稳定，植物对硝态氮的吸收速率加快，硝态氮浓度逐渐降低;另一方面，人工介质表面生物膜厚度增加，在生物膜内部形成厌氧环境，有利于反硝化细菌的生N2排出水体.在硝态氮的净化过程中，微生物单元去除率η4>植物单元去除率η3>其他作用去除率η2，表明微生物在组合型浮床去除水体中硝态氮的过程中发挥着主要作用.
由图 2(c)和2(d)可知，实验进行10 d后，4组实验出水中总氮浓度趋于稳定，浮床D实验出水中总氮平均浓度最低，平均去除率为70.5%，明显高于浮床B对总氮的平均去除率(32.5%);其中植物单元和微生物单元对总氮的去除率分别为20.6%和37.7%，大于其他作用去除率，表明植物的吸收作用和微生物的硝化-反硝化作用是去除总氮的两个主要途径，且微生物的作用占主要地位.在本实验后期，植物根系脱落的腐殖质进入水体，水体中的有机氮浓度增加，出水中总氮浓度达到动态平衡.在传统的植物浮床系统中，植物的生长速率和吸收能力限制了其对污染物的净化能力，而在组合型浮床中，微生物的硝化-反硝化作用极大地提高了对水体中氮的去除能力.
2.1.3 组合型浮床的增效作用
通过计算浮床D净化氨氮、硝态氮、总氮的增效作用去除率η5，探究微盐碱水体中碱蓬植物与微生物净化水体的协同增效作用.由图 2(d)可知，与淡水中植物和微生物的增效作用不同，浮床D对氨氮的去除率η1小于η2、η3、η4之和，表明在微盐碱环境中碱蓬植物和枯草杆菌在去除氨氮过程中没有产生协同增效作用，而浮床D净化硝态氮和总氮的增效作用去除率分别为12.2%、0.3%，表明浮床D对硝态氮的去除产生了一定的增效作用，而对总氮的去除没有产生明显的增效作用.
在微盐碱水体中，植物的生长受到抑制，根系活力下降，光合作用速率降低，植物细胞通过无机离子和有机溶质调节细胞内外渗透压.有研究表明，盐度能够影响根系分泌物的种类和数量，使植物根际微环境发生变化，从而对微生物活性和种类产生影响.王郑等采用水生植物与人工填料构建的组合型浮床对某农家乐污水进行净化实验，研究结果表明，组合型浮床对氨氮和总氮的去除效率为88.67%、73.88%，进一步的计算结果表明，组合型浮床去除农家乐污水中氨氮和总氮的增效作用去除率均达到10%以上.与此研究结果不同，在本研究中，受盐碱胁迫的影响，植物+微生物组合型浮床对氨氮、总氮没有产生与淡水环境中相同的协同增效作用.
2.2 组合型浮床对磷的净化效果2.2.1 不同组合浮床对磷的净化效果
不同组合型浮床对总磷的净化效果如图 3.从中可知，A组实验出水中总磷浓度没有出现显著差异(P < 0.05).在B组和D组实验中，实验进行的0~4 d，总磷浓度下降缓慢;在4~10 d，总磷浓度显著下降(P < 0.05)，10 d后出水总磷浓度基本趋于稳定(P < 0.05);在C组中，实验进行10 d后，出水总磷浓度基本趋于稳定(P < 0.05)，可能是实验前期植物生长状态尚未稳定，速率较慢，10 d后植物适应了相应的生长环境，对磷的吸收速率增加并趋于稳定. 4组实验出水总磷平均浓度大小顺序为：A组>B组>C组>D组，表明植物+微生物组合型浮床对水体中总磷的去除效果均高于其他3组.
图 3 不同组合浮床对总磷的净化效果
2.2.2 植物和微生物对磷的净化作用
按照1.6节中的公式分别计算4组浮床对总磷的去除率和各单元的去除率.浮床B和浮床D对总磷的平均去除率分别为14.3%和34.7%，其中η4(21.6%)>η3(13.6%)>η2(0.7%)，表明植物+微生物组合浮床型浮床对总磷的去除率显著高于植物浮床，且微生物在组合型浮床去除水体中磷的过程中发挥着主要作用.一方面，磷元素是微生物生长繁殖的必须元素，微生物对磷的富集和降解作用能够有效降低水体中总磷浓度;另一方面，人工介质对分子态和颗粒态的磷有一定的吸附作用.其他作用去除率η2几乎为0，表明其他作用包括曝气、光照等对水体中总磷浓度几乎没有影响.然而，植物+微生物组合型浮床对总磷的增效作用去除率为-1.3%，表明植物+微生物组合型浮床对水体中总磷的去除没有产生协同增效作用.
对4组实验出水中的总磷检测结果表明，水体中磷的去除机制包括植物吸收、微生物富集和降解作用，而植物对磷的吸收作用受植物吸收能力的限制，对水体中总磷的去除率不高，而在植物和微生物联合作用下，能够有效降低水体中总磷浓度，且微生物的富集作用和人工介质的吸附作用占主要地位.然而，受植物吸收能力和微生物对磷的降解能力的限制，组合型浮床对总磷的去除效果有限，这与杨林燕等的研究结果相似.选择具有较强吸附能力的人工介质或填料以及选用具有较强富集效应的聚磷菌等方法能够进一步提高组合型浮床对总磷的去除效果.
2.3 组合型浮床对高锰酸盐指数的净化效果2.3.1 不同组合浮床对高锰酸盐指数的净化效果
对4组实验进出水中高锰酸盐指数进行监测，高锰酸盐指数变化如图 4.实验开始后，A组和B组出水中高锰酸盐指数均出现小幅降低，在实验进行4 d后即趋于稳定(P < 0.05);在添加有微生物的C组和D组中，从实验开始到第8 d，出水中高锰酸盐指数显著降低(P < 0.05);在实验进行8 d后实验出水中高锰酸盐指数之间均没有显著性差异(P < 0.05)，4组实验出水中高锰酸盐指数平均值大小顺序为：A组>B组>C组>D组，表明植物+微生物组合型浮床对高锰酸盐指数的去除效果最佳.
图 4 不同组合浮床对高锰酸盐指数的净化效果
2.3.2 植物和微生物对高锰酸盐指数的净化作用
水体中过高浓度的有机物是导致水体恶臭的主要原因，对水体中有机污染物的去除机制主要有微生物的降解、植物根系的截留和人工介质或填料的吸附作用，其中微生物的降解作用占主要地位.与本研究结果相似，通过计算得到组合型浮床在去除高锰酸盐指数过程中各单元的去除效率，其中，η4(44.5%)>η3(17%)>η2(11.2%)，微生物对高锰酸盐指数的去除作用明显大于植物，表明微生物的降解作用在去除高锰酸盐指数的过程中发挥着主要作用.水体中的有机污染物能够为微生物提供碳源、氮源、无机盐等营养物质，为微生物的生长和繁殖提供能量来源.
在本研究中，浮床D对高锰酸盐指数的平均去除效率为70.8%，明显高于浮床B(28.2%)，其中增效作用去除率为-1.9%，表明在微盐碱环境中，碱蓬植物和枯草杆菌之间没有产生协同增效作用，较高的去除率是植物和微生物联合作用的结果.
2.4 浮床植物的生长状况
植物的生长状态是反映水质改善的一个关键因素.植物可以通过根部吸收、吸附等作用去除水体中的营养盐.
实验初期，浮床B和浮床D中的碱蓬植物生长良好，根部长出新根，并有新芽长出，植株高度明显增加，植株顶部有新芽长出，实验进行6 d左右时，浮床D中植物根部有微生物黏膜形成.实验开始和结束时，B组和D组实验中碱蓬植物的各项生长指标如表 2. B组和D组中的植物鲜重、株高和根长均有所增加，表明在增加曝气、人工介质等条件下，盐生植物碱蓬可以在浮床上正常生长. D组实验中植物各项生长指标的增加量均高于B组，这表明植物+微生物组合型浮床比仅有植物的浮床更适合浮床植物的生长，这可能与D组中的微生物有关.一方面，微生物通过降解作用，将水体中的污染物降解为可直接被植物吸收利用的小分子物质和微量元素，并促进植物的生长;另一方面，微生物可以通过降低植物病原体对植物的毒害作用，提高植物的生存能力.
表 2 实验前后浮床B、D中碱蓬生长指标
2.5 浮床微生物特征
实验结束时对4组实验进出水中细菌总数进行检测结果表明，C组和D组实验出水中细菌总数显著高于A组和B组.因此，在97%相似水平下从C组、D组中提取微生物的OTUs代表序列，用Mothur方法与SILVA的SSUrRNA数据库进行物种注释分析，获得分类学信息，并得出门水平的细菌群落结构相对丰度，如图 5所示.结果显示，浮床微生物主要由10个门类组成，分别是Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Cyanobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Verrucomicrobia、Gemmatimonadetes、Gracilibacteria、Hydrogenedentes，两组实验中优势菌种均为Proteobacteria.
图 5 门水平上微生物群落相对丰度分布
对不同样品在97%一致性阈值下的Alpha Diversity分析指数进行统计分析，结果如表 3. C组、D组样品文库覆盖率均在99.9%以上，表明本研究样品中的大多数微生物种类都被检测到了.由样品菌群丰富度指数(chao1指数和ACE指数)可知，D组浮床中微生物的丰度高于C组，由样品多样性指数(Shannon指数和Simpson指数)可知，D组浮床中微生物的多样性也高于C组.这些研究结果表明，与仅安装人工介质的浮床C相比，浮床D中微生物具有更高的丰富度和多样性，进而说明在浮床上种植碱蓬植物有利于微生物的生长和繁殖，这与浮床D具有较高的污染物去除率的结果相一致.
表 3 浮床微生物群落多样性
浮床植物根系可以为微生物提供附着位点，根系泌氧为微生物的新陈代谢提供氧气，植物根际为微生物提供适宜生长和繁殖的微环境.一方面，浮床C和浮床D上安装的人工介质为微生物提供了充足的附着位点，有利于微生物的生长和繁殖;另一方面，人工介质可以吸附氮、磷和小分子有机物等，这些物质又可以为微生物提供营养，进一步促进了微生物的生长和繁殖.
为了探究不同变量之间的相互作用关系，对植株鲜重增量、细菌总量及水体中各污染物的去除率进行主成分分析(PCA)，提取得到第1、第2主成分，如图 6.其中，第1主成分主要反映了细菌总量和水体各污染物去除率的关系，第2主成分主要反映了植物鲜重增量与水体中各污染物去除率之间的影响.分析结果表明，浮床植物的营养吸收作用和微生物的降解作用在水体净化过程中发挥着重要作用，其中，微生物在植物+微生物组合型浮床净化微盐碱水体中发挥着主要作用.
图 6 组合型浮床实验中各变量PCA分析
综上所述，组合型浮床对富营养化微盐碱水体具有较好的净化效率，一方面盐生植物碱蓬对微盐碱环境具有一定的耐受能力，通过增加曝气等条件，碱蓬植物能够在微盐碱水体中生长，并通过吸收和吸附作用去除微盐碱水体中的营养盐;另一方面，人工介质中的微生物通过富集和降解作用，极大地降低了微盐碱水体中污染物浓度.高通量测序结果表明，组合型浮床有利于微生物的生长和繁殖，从而强化了组合型浮床对营养盐的去除效果.通过比较植物单元和微生物单元对污染物的去除率，表明微生物的降解作用在植物+微生物组合型浮床净化富营养化微盐碱水体的过程中发挥主要作用.与本研究结果相似，王国芳等探究了组合型浮床中的水生植物单元、水生动物单元、微生物单元对污染物的去除率，结果表明，人工介质附着的微生物是氮磷等污染物的净化主体，其中微生物单元对总氮、总磷、高锰酸盐指数的去除率分别为48.5%、46.7%、49.9%，均高于水生植物和水生动物单元.
植物根系分泌的低分子量有机酸、小分子量蛋白质等物质能够改善植物根部微环境，并对微生物的生长和繁殖产生影响.不同植物根系分泌物的种类和数量不同.刘雯等研究了茭白和美人蕉植物根系分泌物与脱氮之间的关系，结果表明，美人蕉根系能够比茭白分泌更多的溶解性有机碳(DOC)，这些可溶性的有机碳可以为污水中微生物提供碳源，有利于氮的反硝化.然而，植物根系分泌物的种类和数量随生存环境的变化而变化，在盐碱环境中，植物分泌的有机酸种类发生了变化，小分子蛋白质活性降低，这些都对微生物的生长和繁殖产生影响. Rocha等研究了盐度对芦苇根系分泌低分子量有机酸的影响，在盐环境中，芦苇根系柠檬酸含量增加，能够对根际微生物的生长和繁殖产生影响.在本研究中，受盐碱胁迫的影响，植物和微生物之间没有出现明显的协同增效作用.在实际应用中可进一步筛选不同的盐生植物和微生物进行搭配，以提高组合型浮床对微盐碱水体的净化效果.具体参见污水宝商城资料或http://www.dowater.com更多相关技术文档。
3 结论
(1) 植物+微生物组合型浮床对富营养化微盐碱水体有较好的净化效果.浮床系统运行稳定后，组合型浮床对水体中的总氮、总磷、高锰酸盐指数的平均去除率分别为70.5%、34.7%、70.7%，显著高于只有碱蓬的植物浮床.
(2) 在微盐碱环境中，植物+微生物浮床对去除硝态氮、总氮增效作用去除率为12.2%和0.3%，对去除氨氮、总磷、高锰酸盐指数的增效作用去除率为负值，表明在微盐碱环境下，盐生植物和微生物之间的增效作用受到不同程度的抑制.
(3) 高通量测序分析结果表明，浮床微生物的优势菌种为Proteobacteria，与仅安装人工介质的微生物浮床相比，组合型浮床更有利于微生物的生长和繁殖.
(4) 主成分分析(PCA)结果表明，浮床植物的吸收作用和微生物的降解作用是水质净化的主要机制，其中微生物对污染物的去除率高于植物.
(5) 该组合型浮床首次将盐生植物与微生物进行组合，用于修复富营养化微盐碱水体，有效提高了组合型浮床的净化效率，同时具有较好的景观效果，在微盐碱水体生态修复中具有很好的应用价值.探究盐碱胁迫下植物根系分泌物与微生物的相互作用机制并筛选不同盐生植物+微生物组合有助于进一步提高浮床的净化效果.
