申请日2017.05.17
公开(公告)日2017.08.25
IPC分类号C12N1/20; C02F3/34; C12R1/01; C02F103/20; C02F101/38; C02F101/16
摘要
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一株脱氮副球菌及其在畜禽养殖场废水处理中的应用，本发明提供的脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)TDFQ‑1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M2017238。该菌株具有生长速度快，环境耐受性强，在有机培养基中生长良好。本发明所述脱氮副球菌具有异养硝化、好氧反硝化能力，可以降低水体中氨氮、硝酸盐等有害物质，特别是对有机物含量较高的畜禽养殖场废水中的氨氮去除，改善养殖环境。该菌株在处理养殖场废水时还可以高效降解其中的氟喹诺酮类抗生素，减少抗生素对土壤和水源的污染，保护人类身体健康。
权利要求书
1.一株分离的脱氮副球菌，其特征在于，所述的脱氮副球菌为脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)TDFQ-1，保藏编号为 CCTCC NO：M2017238。
2.权利要求1所述的脱氮副球菌的制备方法，包括：将脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)TDFQ-1种子液按1-10%(V/V)接种量接种于50L发酵罐中扩大培养，发酵罐装液量为30-35L，控制搅拌转速维持溶氧在15%-18%，28-32℃培养18-22h收集发酵液。
3.所述的发酵罐，其灌装的发酵培养基的配方包括：蛋白胨 5g，酵母膏 5g，NaCl 2g，MgSO4 0.03g，Na2HPO4 0.25g，KH2PO4 0.75g， FeSO4 0.03g，MnSO4 0.01g，CaCl2 0.2g，甘油6.0g，加水定容至1L，调节PH7.5;
权利要求1所述的脱氮副球菌在畜禽养殖场废水处理中的应用。
4.权利要求1所述的脱氮副球菌在降解抗生素中的应用。
5.权利要求1所述的脱氮副球菌在处理同时含有高氨氮和抗生素的污水中的应用。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的应用，所述的抗生素包括诺氟沙星、环丙沙星或恩诺沙星。
说明书
一株脱氮副球菌及其在畜禽养殖场废水处理中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株脱氮副球菌的分离鉴定、培养方法及其在畜禽养殖场废水处理中的应用。
背景技术
随着社会和经济的发展，集约化畜禽养殖规模越来越大，生产效率提高，经济效益增加，但同时大量畜禽排泄物和废水的产生，造成畜禽业发展与环境污染之间的矛盾日益凸显，粪尿废水过度集中给生态环境带来了极大的压力。畜禽养殖业是我国农业的主导产业之一，而畜禽养殖污染则成为农业面源污染的主要原因之一。大量的畜禽养殖废水成为污染源，如得不到及时处理，必将对环境造成极大危害，导致生态环境恶化，畜禽产品品质下降并危及人体健康，养殖废水治理技术的滞后也将严重制约养殖业的可持续发展。
集约化养殖废水主要来源于动物的排泄物及冲洗用水，具有较高浓度的氨氮和有机物，化学需氧量高，臭味大。有研究表明，猪场废水中氨氮浓度高达800—2000mg/L，化学需氧量高达5000—20000mg/L。废水若未得到有效处理直接排入水体容易造成水体富营养化和地下水污染。目前，对这类废水的处理主要包括物化、生化和自然生态等，其中生物脱氮工艺简单，成本低，对环境负荷小，脱氮更彻底。脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)是异养硝化、好氧反硝化菌菌种之一，能直接把氨态氮转化为最终气态产物逸出，使同时硝化反硝化生物脱氮技术成为可能。与传统的自养硝化细菌相比较，异养硝化细菌生长速率快、作用速率高。
畜禽养殖业中广泛使用抗生素来预防和治疗动物疾病，但这些抗生素只有很少一部分被动物机体利用，绝大部分通过尿液和粪便排出体外，养殖废水是抗生素污染的重要来源，环境中抗生素富集会对生态环境和人类健康造成威胁。对抗生素污染的处理方法主要有非生物降解和生物降解2种，微生物降解是生物降解的方式之一。探寻新的抗生素降解微生物菌株可以为未来微生物资源和技术处理环境中抗生素类污染物提供参考。
发明内容
本发明的目的是针对现有养殖废水处理技术的不足，提供了一株脱氮副球菌，该菌株在去除氨氮的同时能够去除养殖废水中的氟喹诺酮类抗生素。所述的脱氮副球菌已于2017年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名：脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)TDFQ-1，保藏编号为CCTCC NO：M2017238地址：中国武汉武汉大学。
本发明的另一个目的在于提供了脱氮副球菌TDFQ-1的制备方法，方法简单，发酵液中有效菌浓度高，适应于大规模生产。
本发明还有一个目的在于提供了脱氮副球菌TDFQ-1的应用，本发明提供的脱氮副球菌可用于同时去除水中的氨氮及氟喹诺酮类抗生素，特别适用于养殖废水的处理。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)TDFQ-1的获得：
申请人自湖北随州猪厂污水中，筛选高效的异养硝化细菌，通过大量筛选，生理生化及16S鉴定，最终筛选获得一株脱氮副球菌菌株，所述的脱氮副球菌已于2017年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名：脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)TDFQ-1，保藏编号为CCTCC NO：M2017238地址：中国武汉武汉大学。
脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)TDFQ-1的生物学特性如下所述：
该菌株在有机和无机培养基中均能生长，在营养琼脂(NA)培养基上繁殖生长形成圆形菌落，菌落大小1-2mm，表面光滑湿润。该菌镜检为革兰氏阴性，单个、成对或成堆，对数生长期为球形或近球形，平均大小为1.1×1.3um，静止期菌体为球形，直径1um。不水解明胶、淀粉;不利用D-阿拉伯糖、精氨酸;可利用蔗糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇为唯一碳源生长;铵盐和硝酸盐都能作为氮源;能用氧或硝酸盐作为电子受体，硝酸盐被还原成氧化亚氮和分子态氮。最适温度30℃，温度范围5-37℃。将其16S rRNA基因测序，结果在NCBI进行blastn比对，发现其16SrRNA与脱氮副球菌(NR 114145.1)的序列同源性最高，相似性为99%。
脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)TDFQ-1的制备方法，包括：
将脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)TDFQ-1种子液按1-10%(V/V)接种量接种于50L发酵罐中扩大培养，发酵罐装液量为30-35L，控制搅拌转速维持溶氧在15%-18%，28-32℃培养18-22h收集发酵液。
所述的发酵罐，其灌装的发酵培养基的配方包括：蛋白胨5g，酵母膏5g，NaCl 2g，MgSO4 0.03g，Na2HPO4 0.25g，KH2PO4 0.75g，FeSO4 0.03g，MnSO4 0.01g，CaCl2 0.2g，甘油6.0g，加水定容至1L，调节PH7.5。
以上所述的方案中，优选的，接种量为3%，发酵罐的装液量为35L，溶氧为16%，培养温度为30℃。
脱氮副球菌TDFQ-1的应用，包括利用本发明的脱氮副球菌TDFQ-1用于处理畜禽废水，或是用于同时处理含有高氨氮和抗生素的污水。
所述的抗生素优选诺氟沙星、环丙沙星或恩诺沙星。
本发明具有如下优点：
本发明提供的脱氮副球菌TDFQ-1具有异养硝化-好氧反硝化作用，在有机和无机培养基中均能生长，异养生长速率大大高于自养生长速率。脱氮副球菌TDFQ-1能在含有高浓度有机物和NH3-N的养殖废水中生长，具有高效硝化和反硝化能力，通过异养硝化作用分解有机物质，将铵态氮转化为硝态氮和亚硝态氮，通过好氧反硝化作用将亚硝态氮还原为氮气或一氧化二氮。本发明菌株在进行硝化作用的同时，可以降解养殖废水中喹诺酮类物质，减少畜禽抗生素的过度使用和排放对土壤和地下水的污染，避免抗生素通过食物链的积累效果对人体健康产生影响。
本发明的脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)TDFQ-1具有易于发酵培养，生产成本低，能够在含高浓度有机物的废水中生长繁殖，把养殖废水中的氨氮转化为新的菌体细胞及无害的N2，高效去除其中的氨氮、总氮，相比较于物理和化学处理法，其具有投资少能耗低的优点。
在NB中培养18h，活菌含量达到5.84×109CFU/ml，在优化后的发酵培养基中培养18h,活菌含量可以达到8.92×109CFU/ml，活菌数提高了52.74%。将TDFQ-1制剂用于处理养猪场废水，用该制剂处理猪场养殖废水，猪场养殖废水中的氨氮和总氮的含量由TDFQ-1处理前的562.08mg/L、645.66mg/L降低到54.21mg/L、85.84mg/L，分别减少90.35%和86.71%。处理鸡场养殖废水，鸡场养殖废水中的氨氮和总氮的含量由TDFQ-1处理前的662.37mg/L、695.83mg/L降低到54.36mg/L、69.11mg/L，分别减少91.79%和90.07%。
在高效去除养殖场废水中的氨氮和总氮的同时，TDFQ-1还可以降解废水中的喹诺酮类抗生素。在猪场养殖废水中，使用TDFQ-1制剂的试验组和不使用该制剂的对照组相比较，，诺氟沙星降解率为93.41%，提高了69.36%;环丙沙星降解率为96.93%，提高了68.59%;恩诺沙星降解率为93.82%，提高了51.35%。使用TDFQ-1的试验组中3种喹诺酮类抗生素的降解率均达到了90%以上。
