申请日2016.05.30
公开(公告)日2016.11.09
IPC分类号G01N30/02; G01N30/06
摘要
本发明公开了一种污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法，包括：对污泥进行冷冻干燥，研磨过筛取样，加替代物，加入甲醇和Na2EDTA‑McIlvaine缓冲液，混匀超声离心提取上清液，将重复三次提取的上清液合并后用超纯水定容，调节pH为3.0;抽滤水样，用超纯水稀释并调节pH为3.0，加入替代物和Na2EDTA·2H2O，放置一个小时;固相萃取采用SAX‑HLB串联系统，用甲醇、超纯水和酸性超纯水活化，然后上柱、淋洗、甲醇洗脱;洗脱液氮吹复溶，用优化好的液质参数定量。本发明优化的超声萃取、固相萃取、液质联用技术能实现复杂基质中抗生素的有效提取和准确定量，可应用于广泛的污水和污泥样品的测定。
权利要求书
1.污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、取一定量的污泥预冻后冷冻干燥24h，研磨过筛后称取1g干污泥，将该干污泥放入50mL的塑料离心管中，加入100μL质量体积浓度为1mg/L的13C3-咖啡因作为替代物;
步骤二、向上述塑料离心管中加入7.5mL的甲醇和7.5mL且pH为4.0的Na2EDTA-McIlvaine缓冲液，混匀振荡1min，超声萃取15min，4000rpm离心5min，取出上清液，备用，再重复两次上述操作;
步骤三、合并步骤二获得的上清液，并用超纯水定容到500mL，然后用浓盐酸调节pH为3.0，获得污泥的稀释样品;
步骤四、取100～500mL的污水水样，用0.7μm的玻璃纤维滤膜进行过滤，超纯水稀释到1000mL，用浓盐酸调节pH值为3.0，加入100μL质量体积浓度为1mg/L的13C3-咖啡因作为替代物，加入0.5g Na2EDTA·2H2O，放置一个小时，间歇振荡以保持Na2EDTA·2H2O的溶解状态，完成污水水样的前处理;
步骤五、将步骤三获得的污泥的稀释样品和经过步骤四前处理后的污水样品分别进行固相萃取，用SAX-HLB小柱串联系统进行污水样品和污泥的稀释样品的固相萃取，所述固相萃取的过程是：依次用6mL甲醇、6mL超纯水和6mL pH为3.0的超纯水进行活化，以5mL/min的流速上柱，拆掉SAX小柱后用5mL的超纯水淋洗HLB小柱，最后用8mL的甲醇洗脱得到洗脱液;
步骤六、将步骤五得到的洗脱液在40℃水浴条件下，氮吹至其中的溶剂完全挥发，加入内标物，再用1mL的10%乙腈+90%0.3%甲酸溶液复溶，得到检测样品;
步骤七、分别以乙腈和0.3%甲酸溶液为流动相，利用超高效液相色谱串联质谱仪对检测样品进行12种目标抗生素的定量分析。
2.如权利要求1所述污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法，其特征在于，步骤二中的超声萃取所采用的功率密度为0.1W/mL。
3.如权利要求1所述污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法，其特征在于，步骤二中的超声萃取是在冰浴中进行。
4.如权利要求1所述的污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法，其特征在于，步骤七中，对检测样品进行12种目标抗生素的定量分析中，超高效液相色谱串联质谱仪的工作参数如下：
色谱参数包括：脱溶剂气温度为450℃，脱溶剂气流量为900L/Hr，锥孔气流速为50L/hr，柱温为40℃;检测时长10min;流动相梯度如下：
质谱参数包括：质谱扫描分三个通道，包括0-3.7min，3.7-5.5min和5.5-10min，上述三个通道分别对应的驻留时间依次为0.019s，0.063s和0.097s。
说明书
污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法
技术领域
本发明涉及抗生素的检测分析领域，具体涉及污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法。
背景技术
抗生素作为一种新型污染物广泛出现在地表水、地下水、土壤甚至饮用水中，尽管浓度水平较低(通常为ng/L～μg/L或μg/kg～mg/kg)，仍可能会对敏感性生物产生急性或慢性的毒害作用。抗生素持续排放形成的选择性压力，还会导致抗性细菌和抗性基因的产生，该类基因片段一旦转移进入致病菌，会严重损害抗生素类药物对人类和动物感染的治疗潜力。污水厂是环境中抗生素的重要来源，被生物体摄入但未被吸收的抗生素会随着排泄物进入污水厂，因而污水和污泥中会存在一定浓度水平的抗生素。
鉴于污水和污泥中抗生素类药物的浓度水平较低，属于微量有机污染物，且污水和污泥中基质成分复杂，一般的检测手段难以满足要求，因此有必要建立新的具有高灵敏度、高特异性的前处理和检测方法，实现该类复杂基质中微量抗生素的准确定量，以供进一步的研究分析。
针对微量抗生素的检测技术，常用的有液相色谱检测技术，包括高效液相色谱-紫外吸收检测技术、高效液相色谱-荧光检测技术和液相色谱串联质谱检测技术，酶联免疫吸附测定法和生物传感器技术，其中液相色谱串联质谱的检测技术灵敏度高、检出限低、稳定性强，因此优选该技术用于分析检测。另外，超高效液相色谱与液相色谱相比，灵敏度和分辨率更高，分析速度更快。对水相中抗生素的富集可采用冷冻干燥法和固相萃取技术，固相萃取技术得出的检测限更低，方法更可靠。对吸附态抗生素的提取可采用超声萃取和加压溶液萃取的方法，两者的回收率相当，但是超声萃取可同时处理多个样品，因而更方便快捷。富集后的抗生素的浓缩方法有旋转蒸发和氮吹浓缩，相较于旋转蒸发，氮吹浓缩耗时较长，但目标物回收率较高且稳定。通过对各个步骤应用技术的比选可以初步制定污水和污泥中抗生素的提取、富集、浓缩和检测的方案，但针对不同的水质特点和目标物特性，仍要进行具体操作条件的优化。
目前针对污水和污泥中抗生素的检测方法多用于污水厂进出水及好氧污泥的检测，而对于厌氧反应器，如厌氧消化池中污水和污泥，尚未形成成熟的抗生素检测方法。由于厌氧反应器中有机化合物种类较多，浓度较高，对抗生素一类微量污染物的检测干扰较为明显，因此需要对厌氧反应器中的污水和污泥的抗生素检测方法进行优化，得出可普遍适用于污水厂各种污水和污泥的抗生素检测方法。目前针对污水中抗生素检测的方法一般采用HLB小柱进行固相萃取(张金,宗栋良,常爱敏,等.水环境中典型抗生素SPE-UPLC-MS/MS检测方法的建立[J].环境化学,2015,34(8):1446-1452)，如果用于厌氧反应器中污水的抗生素检测，容易使较多有机干扰物截留在HLB小柱内，影响抗生素的检测准确性，因此需要优 化萃取过程，尽可能减少有机杂质的干扰。目前针对污泥中抗生素的检测方法一般采用超声萃取(Yμan XJ,Qiang ZM,Ben WW.Rapid detection of mμltiple class pharmaceμticals in both mμnicipal wastewater and slμdge with μltra high performanceliqμid chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of EnvironmentalSciences,2014,26(9):1949-1959)，但超声条件尚未形成统一的参数，而且提取液的成分和用量方面还需要进一步优化。
发明内容
本发明针对复杂的污水和污泥基质中微量的抗生素污染物，提出一种污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法，该检测方法灵敏度高、分辨率高、回收率高且可应用于污水厂各种污水和污泥样品的检测分析。
本发明提出的一种污水和污泥中12种典型抗生素的同时检测方法，包括以下步骤：
步骤一、取一定量的污泥预冻后冷冻干燥24h，研磨过筛后称取1g干污泥，将该干污泥放入50mL的塑料离心管中，加入100μL质量体积浓度为1mg/L的13C3-咖啡因作为替代物;
步骤二、向上述塑料离心管中加入7.5mL的甲醇和7.5mL且pH为4.0的Na2EDTA-McIlvaine缓冲液，混匀振荡1min，超声萃取15min，4000rpm离心5min，取出上清液，备用，再重复两次上述操作;
步骤三、合并步骤二获得的上清液，并用超纯水定容到500mL，然后用浓盐酸调节pH为3.0，获得污泥的稀释样品;
步骤四、取100～500mL的污水水样，用0.7μm的玻璃纤维滤膜进行过滤，超纯水稀释到1000mL，用浓盐酸调节pH值为3.0，加入100μL质量体积浓度为1mg/L的13C3-咖啡因作为替代物，加入0.5g Na2EDTA·2H2O，放置一个小时，间歇振荡以保持Na2EDTA·2H2O的溶解状态，完成污水水样的前处理;
步骤五、将步骤三获得的污泥的稀释样品和经过步骤四前处理后的污水样品分别进行固相萃取，用SAX-HLB小柱串联系统进行污水样品和污泥的稀释样品的固相萃取，所述固相萃取的过程是：依次用6mL甲醇、6mL超纯水和6mL pH为3.0的超纯水进行活化，以5mL/min的流速上柱，拆掉SAX小柱后用5mL的超纯水淋洗HLB小柱，最后用8mL的甲醇洗脱得到洗脱液;
步骤六、将步骤五得到的洗脱液在40℃水浴条件下，氮吹至其中的溶剂完全挥发，加入内标物，再用1mL的10%乙腈+90%0.3%甲酸溶液复溶，得到检测样品;
步骤七、分别以乙腈和0.3%甲酸溶液为流动相，利用超高效液相色谱串联质谱仪对检测样品进行12种目标抗生素的定量分析。
进一步讲，步骤二中的超声萃取所采用的功率密度为0.1W/mL。
步骤二中的超声萃取是在冰浴中进行。
步骤七中，对检测样品进行12种目标抗生素的定量分析中，超高效液相色谱串联质谱仪的工作参数如下：
色谱参数包括：脱溶剂气温度为450℃，脱溶剂气流量为900L/Hr，锥孔气流速为50L/hr，柱温为40℃;检测时长10min;流动相梯度如下：
质谱参数包括：质谱扫描分三个通道，包括0-3.7min，3.7-5.5min和5.5-10min，上述三个通道分别对应的驻留时间依次为0.019s，0.063s和0.097s。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明的十二种目标物分属于四个不同的抗生素类别，结构、性质各有不同，但在本方法中，针对高有机质浓度的厌氧污水和污泥，同时可以得到准确定量分析。
(2)污水厂实际水样中目标物浓度波动很大，在本方法中首先采用稀释的方法减小复杂基质的影响(一般稀释到溶解性化学需氧量SCOD值低于100mg/L)，并在固相萃取过程中，采用SAX-HLB小柱串联系统进行萃取，进一步降低萃取和检测过程中的杂质干扰，方法的线性范围可达三个数量级，满足污水厂各种污水和污泥中抗生素的定量需求。
(3)污水厂污泥中的抗生素主要是以吸附态存在，在超声萃取过程中，既要保证充分解吸到提取液中，又要避免抗生素发生降解，因此在处理过程中采用较小的功率密度(0.1W/mL)，并加入冰浴;采用优化的提取液成分和用量，提高萃取效果。
