申请日2016.03.22
公开(公告)日2017.09.29
IPC分类号C12Q1/68; C12Q1/06; C12M1/36; C12M1/34
摘要
本发明涉及一种迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法，主要解决现有技术中测量速度较慢、不便捷、结果不准确的问题。本发明通过采用一种迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法，包括箱体、细菌富集和核酸分子提取设备，所述细菌富集和核酸分子提取设备包括试剂管放置位置(1)和试剂管放置位置(4)、滤膜(2)、吸附层(3)反应池(5)、光源(6)、滤光片(7)、感光器(8)以及至少四个阀门的技术方案较好地解决了上述问题，可用于测量液体样品中细菌含量中。
权利要求书
1.一种迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法，在液体样品中细菌含量测量装置上，进行液体样品中细菌含量的测量;所述装置包括箱体、细菌富集和核酸分子提取设备，所述细菌富集和核酸分子提取设备包括试剂管放置位置(1)和试剂管放置位置(4)、滤膜(2)、吸附层(3)反应池(5)、光源(6)、滤光片(7)、感光器(8)以及至少四个阀门，所述试剂管放置位置(1)底部与滤膜(2)上方空间连通，滤膜(2)下方空间分为两路，一路与阀门a入口端相连，另一路与阀门b入口端相连，阀门a出口端与废液池相连，阀门b出口端通过管道与吸附层(3)入口侧相连，吸附层(3)出口侧的管道分为两路，一路与阀门c入口端相连，阀门c出口端与废液池相连，另一路经过阀门d后与反应池(5)相连;试剂管放置位置(4)底部与通过管道与阀门b与吸附层入口侧之间的管道相连;光源(6)为反应池(5)提供染料分子激发能量，产生的荧光透过滤光片(7)后由感光器(8)接收;滤膜(2)上方空间的顶部、试剂管放置位置(4)的底部均设有金属尖刺，当试剂管放置在试剂管放置位置(1)或试剂管放置位置(4)上时可以刺破试剂管底部的铝箔;油田污水和成品油中细菌含量的测量步骤包括：
(a)在试剂管中装入样品，放置于试剂管放置位置(1)，试剂管底部铝箔包装被下部金属尖刺破，液体流入滤膜上方，小于滤膜孔径的液体穿过滤膜后进入废液池;
(b)当试剂管中的样品全部流过滤膜后，程序自动控制试剂管更替为预置在箱体内的盛装乙醇溶液的试剂管，重复上述加压流程以冲洗滤膜，然后继续自动控制试剂管更替为盛装去离子水或缓冲液的试剂管进行冲洗操作;
(c)对滤膜的冲洗完成后，在试剂管放置位置(1)上更换为盛装细菌裂解液的试剂管，将试剂管中的细菌裂解液流经吸附层(3)后进入废液池;
(d)在试剂管放置位置(4)上放置盛装洗涤液的试剂管进行冲洗，移除细菌裂解液中的杂质;
(e)冲洗结束后，在试剂管放置位置(4)上放置盛装缓冲液的试剂管，缓冲液流经吸附层3时将DNA洗脱下来，冲洗至反应池(5);
(f)当核酸放大反应在反应池(5)中发生时，光源(6)发出的光激发反应池(5)中的染料分子，产生的荧光由感光器(8)接收，染料分子的浓度与溶液中核酸分子的浓度正相关，由此判断核酸分子的初始浓度。
2.根据权利要求1所述迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法，其特征在于当试剂管放置在试剂管放置位置(1)上时，在试剂管上部放置活塞，将试剂管中的试剂向下压入滤膜(2)上方的空间中。
3.根据权利要求1所述迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法，其特征在于所述细菌富集和核算分子捕捉设备集成在所述箱体内。
4.根据权利要求1所述迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法，其特征在于阀门a～阀门d为程序控制的电磁阀，或采用微流控的微阀技术，由气泵控制其开关。
5.根据权利要求1所述迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法，其特征在于反应池(5)的上方为开口或透光性材料，内部预置反应母液或冷冻干燥后的试剂球，核酸洗脱液流入反应池(5)后与预置溶液或试剂球混合。
6.根据权利要求1所述迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法，其特征在于感光器(8)出的信号被送至信号处理单元进行分析。
7.根据权利要求1所述迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法，其特征在于试剂管放置位置(1)或(4)置于较高位置，便于液体下流至较低位置。
8.根据权利要求1所述迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法，其特征在于当采用PCR方法时，需要在反应池(5)周边设置快速加热-冷却模块以实现变性-退火-延伸的温度循环;当采用等温放大方法的时候，反应池周围只需要设置加热模块即可。
9.根据权利要求1所述迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法，其特征在于试剂管的更换通过自动控制系统完成。
说明书
迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法
技术领域
本发明涉及一种迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法。
背景技术
由细菌等微生物的生命活动引起的材料的腐蚀破坏被称为微生物腐蚀(MIC)。MIC是一种普遍存在的现象。油气田、油罐、加油站、油路甚至汽车油箱中都存在着大量的细菌。每年因腐蚀而造成的经济损失在一百亿美元以上。其中最主要的腐蚀微生物为硫酸盐还原菌(SRB)，造成了美国生产油井77%以上的腐蚀损失。SRB能够在无氧环境下，以环境中的有机物为碳源，利用细菌生物膜内产生的氢，将硫酸盐还原为硫化氢，从氧化还原反应中获得能量，而金属也在此过程中被氧化腐蚀。目前SRB的检测方法主要有三种，分别为：培养检测技术、显微镜检测技术和生化直接检测技术。培养检测技术是目前应用较为广泛的一种方法，其原理是将样品做梯度稀释，在适当的培养基上进行培养，最终根据稀释倍数和细菌的阳性反应进行定量。该法的主要依据是美国石油协会API推荐的绝迹稀释法，我国石油行业标准SY/T 0532-2012《油田注入水细菌分析方法绝迹稀释法》中也有详细规定。相关专利已有报道(如CN102329851A、CN103983636A、CN1769472A、CN200510010459等)，目前市场上也存在SRB专用测试瓶可供购买。培养检测技术的优点在于操作简单、成本低廉，结果准确性较高。其主要缺点在于耗时长(2-14天)，培养菌种不完全导致定量结果偏低。一旦阴性对照组出现菌类生长，需要重做实验，很难保证重新采样结果与原样本一致。
显微镜检测技术结合了特异性染色方法与荧光计数方法，将荧光基团选择性地标记到SRB的表面，然后在荧光显微镜下计数以定量。但此种方法仍然需要短期培养以提高菌类浓度，培养周期在两天左右。虽然其操作相对简单、定量成本低，但需要染料分子的高特异性，且不能提供细菌活性的相关信息。
生化直接检测技术包含了多种具体方式【关淑霞叶海春范莹莹油田污水中硫酸盐还原菌检测技术的研究进展化学与生物工程2012 29 17】，可以检测SRB内部或表面的某种蛋白(如用酶联免疫吸附剂测定ELISA方法测定腺苷-5’-磷酸硫酸盐还原酶APS【如GB2354072B、CN103983636A、EP272916A1】)，可以检测SRB特异性的核酸分子序列(如聚合酶链式反应PCR方法【CN105112543A、CN1769472A、CN200510010459】、荧光原位杂交FISH方法【王明义梁小兵郑娅萍赵由之魏中青硫酸盐还原菌鉴定和检测方法的研究进展微生物学杂志2005 25 81】)，也可以检测SRB的代谢产物(如电位法或指示剂法测定H2S)【李婉义赵自光硫酸盐还原菌菌量检测方法的研究—硫离子选择电极法化学传感器1991 11 64】。这些检测方法准确性高、特异性高、检测周期短(几小时左右)，但操作复杂，一般只能在专门的生化实验室内由受过训练的专业人员进行实验。其中的APS检测法相对简单，国外已有商品化的试剂盒出售，可以实现快速现场测量，但该方法的缺点有：1)同时检出所有具有APS的细菌种类，结果可能偏高;2)结果以颜色变化为指标定量不准确;3)细菌裂解可能不彻底造成检出结果偏低。
综上所述，目前缺乏一种快速、便捷、准确的现场测定方法和装备。本专利描述的是一种基于核酸分子放大技术的样品中细菌的特异性、自动化、可携带式定量检测装置。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有技术中测量速度较慢、不便捷、结果不准确的问题，提供一种新的迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法。该方法具有快速、便捷、准确的优点。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：一种迅速测量油田污水和成品油中细菌含量的方法，在液体样品中细菌含量测量装置上，进行液体样品中细菌含量的测量;所述装置包括箱体、细菌富集和核酸分子提取设备，所述细菌富集和核酸分子提取设备包括试剂管放置位置(1)和试剂管放置位置(4)、滤膜(2)、吸附层(3)反应池(5)、光源(6)、滤光片(7)、感光器(8)以及至少四个阀门，所述试剂管放置位置(1)底部与滤膜(2)上方空间连通，滤膜(2)下方空间分为两路，一路与阀门a入口端相连，另一路与阀门b入口端相连，阀门a出口端与废液池相连，阀门b出口端通过管道与吸附层(3)入口侧相连，吸附层(3)出口侧的管道分为两路，一路与阀门c入口端相连，阀门c出口端与废液池相连，另一路经过阀门d后与反应池(5)相连;试剂管放置位置(4)底部与通过管道与阀门b与吸附层入口侧之间的管道相连;光源(6)为反应池(5)提供染料分子激发能量，产生的荧光透过滤光片(7)后由感光器(8)接收;滤膜(2)上方空间的顶部、试剂管放置位置(4)的底部均设有金属尖刺，当试剂管放置在试剂管放置位置(1)或试剂管放置位置(4)上时可以刺破试剂管底部的铝箔;油田污水和成品油中细菌含量的测量步骤包括：
(a)在试剂管中装入样品，放置于试剂管放置位置(1)，试剂管底部铝箔包装被下部金属尖刺破，液体流入滤膜上方，小于滤膜孔径的液体穿过滤膜后进入废液池;
(b)当试剂管中的样品全部流过滤膜后，程序自动控制试剂管更替为预置在箱体内的盛装乙醇溶液的试剂管，重复上述加压流程以冲洗滤膜，然后继续自动控制试剂管更替为盛装去离子水或缓冲液的试剂管进行冲洗操作;
(c)对滤膜的冲洗完成后，在试剂管放置位置(1)上更换为盛装细菌裂解液试剂管，将试剂管中的细菌裂解液流经吸附层(3)后进入废液池;
(d)在试剂管放置位置(4)上放置盛装洗涤液的试剂管进行冲洗，移除细菌裂解液中的杂质;
(e)冲洗结束后，在试剂管放置位置(4)上放置盛装缓冲液的试剂管，缓冲液流经吸附层3时将DNA洗脱下来，冲洗至反应池(5);
(f)当核酸放大反应在反应池(5)中发生时，光源(6)发出的光激发反应池(5)中的染料分子，产生的荧光由感光器(8)接收，染料分子的浓度与溶液中核酸分子的浓度正相关，由此判断核酸分子的初始浓度。
上述技术方案中，优选地，当试剂管放置在试剂管放置位置(1)上时，在试剂管上部放置活塞，将试剂管中的试剂向下压入滤膜(2)上方的空间中。
上述技术方案中，优选地，所述细菌富集和核算分子捕捉设备集成在所述箱体内。
上述技术方案中，优选地，阀门a～阀门d为程序控制的电磁阀，或采用微流控的微阀技术，由气泵控制其开关。
上述技术方案中，优选地，反应池(5)的上方为开口或透光性材料，内部预置反应母液或冷冻干燥后的试剂球，核酸洗脱液流入反应池(5)后与预置溶液或试剂球混合。
上述技术方案中，优选地，感光器(8)出的信号被送至信号处理单元进行分析。
上述技术方案中，优选地，试剂管放置位置(1)或试剂管放置位置(4)置于较高位置，便于液体下流至较低位置。
上述技术方案中，优选地，当采用PCR方法时，需要在反应池(5)周边设置快速加热-冷却模块以实现变性-退火-延伸的温度循环;当采用等温放大方法的时候，反应池周围只需要设置加热模块即可。
上述技术方案中，优选地，试剂管的更换通过自动控制系统完成。
本发明中，细菌富集是通过样品流经滤膜实现的。当样品加入后，样品管底部铝箔包装被下部金属尖刺破，液体流入滤膜2上方，此时在上方施加压力，推动液体经过滤膜，大于滤膜孔径的固体物质被留在滤膜上，液体流出。此时阀门a开启，阀门b关闭，废液流出至废液池。当样品为油田废水等水相物质时，采用亲水性滤膜，滤膜尺寸应在0.5微米以下，以确保目标微生物能够保留在滤膜上。当样品为成品油等油相物质时，采用亲油性滤膜。当样品全部流经滤膜后，程序自动控制样品管更替为预置在箱体内的乙醇溶液，重复上述加压流程以冲洗滤膜。继续更替为去离子水或合适pH的缓冲液进行冲洗。当冲洗结束后，加入细菌裂解液，等待一定时间后开始加压，此时阀门a关闭，阀门b开启，细菌裂解液进入核酸提取单元。核酸提取单元中预置了DNA吸附柱(吸附层3内)，上游流入的细菌裂解液在流经吸附层3时，其中的DNA被吸附在吸附层3上，液相流入废液池。此时阀门c开，阀门d关闭。试剂管放置位置4上的试管内为预置的洗涤液，同样通过压力使其流经吸附层3以带走杂质。更换试剂管放置位置4上的试管以重复洗涤流程。当洗涤结束时，更换试剂管放置位置4上的试管内溶液为少量pH合适的缓冲液。此时阀门c关闭，阀门d开启。缓冲液流经吸附层3时将DNA洗脱下来，冲洗至反应池5。反应池5中预置了核酸放大反应需要的各个成份，可以为配制好的母液，也可以为了长期保存目的放置冷冻干燥后的试剂，由冲入的缓冲液溶解。放大及检测单元由反应池5、光源(卤灯或LED)6、滤光片7、感光器(CCD或PMT)8组成。当核酸放大反应在反应池5中发生时，光源6发出的光激发反应池5中的染料分子，产生的荧光由感光器8接收。染料分子的浓度与溶液中核酸分子的浓度正相关，可以由此判断核酸分子的初始浓度。
本发明所述装置包含了细菌富集、核酸分子提取和放大读出三个单元，是一种整合型可携带式自动化仪器，能够实现现场测量。细菌富集单元采用样品流经过滤膜的方式实现细菌的分离和富集，所需时间与培养法相比大大缩短。核酸分子提取和放大读出均在微流控平台上实现。提取部分采用二氧化硅吸附柱技术吸附DNA分子，由程序控制以压力推动试剂分别流经吸附柱，最终得到纯净的核酸分子。在放大读出单元中，可以选择性采用PCR方法或环介导等温放大(LAMP)方法。与常规PCR方法相比，LAMP方法的特异性更高，对反应介质中杂质的耐受性更高，反应效率更高，检出时间更短(可缩短至20分钟)，且不需要变性-退火-延伸的温度循环，降低了对温控模块的要求。所有操作由程序控制，除加样外无需手动操作，提高了测试的平行性和便捷性。
