申请日2015.02.28
公开(公告)日2015.12.09
IPC分类号C12N1/20; C12R1/085; C02F3/34
摘要
本发明公开一种蜡质芽孢杆菌(Bacillus?cereus)在处理制革废水COD中的应用，利用蜡质芽孢杆菌处理制革废水COD包括以下步骤：(l)培养基配制;(2)发酵：将蜡质芽孢杆菌菌种接种至装有培养基的摇瓶，进行发酵得发酵液;(3)生物絮凝剂的提取：发酵液经离心、萃取、再离心、真空冷冻干燥得生物絮凝剂产品;(4)废水处理：将生物絮凝剂加入装有制革废水的烧杯中，于磁力搅拌器上进行搅拌处理。本发明用新的生物絮凝剂处理制革废水中的COD，去除效率可达到75.6%，发挥生物絮凝剂绿色环保、不产生二次污染等独特性能，为去除制革废水中的高浓度COD提供了新方法，拓宽了对蜡质芽孢杆菌功能方面的应用，具有较强的应用价值。
权利要求书
1.一种蜡质芽孢杆菌(Bacilluscereus)的应用，其特征在于：所述蜡质芽孢杆菌其保藏号为CCTCCM2014513，应用于降低制革废水中COD。
2.根据权利要求1中所述的一种蜡质芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述蜡质芽孢杆菌由制革厂的活性污泥中培育和驯化而得。
3.根据权利要求1或2中所述的一种蜡质芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述培育和驯化步骤如下：(1)菌种的富集培养：
采集制革厂的活性污泥接种至已灭菌并冷却的LB培养基中，污泥与培养基的培养比例是体积比约1:8-12，于28-32℃摇床培养46-50h，LB培养基配制如下：蛋白胨8-12g，酵母膏4-7g，NaCl8-12g，加蒸馏水到1000mL，pH6.8-7.2，115-125℃灭菌15-25min;
(2)菌种的驯化：
将5mL富集培养菌液接种于100mL含有制革废水的LB培养基中28-32℃振荡培养45-50h，并逐渐增加制革废水的量至40mL、60mL、80mL，逐级驯化;
(3)菌种的分离：
通过稀释平板法，以固体LB培养基为分离培养基，从已驯化的菌液中分离出各种细菌，并对各菌株进行纯化，得到蜡质芽孢杆菌菌种。
4.根据权利要求3中所述的一种蜡质芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述培育和驯化还包括生物絮凝剂产生菌的筛选，如以下步骤：
(1)初筛
将分离纯化出的蜡质芽孢杆菌菌株接种于絮凝培养基中进行培养，将培养液离心，取上清液进行絮凝活性的初筛，即：取2mL培养液加入100mL4g/L高岭土悬浮液中，同时以不加培养液的高岭土悬浮液进行对照，观察，以是否出现絮凝来判断是否具有絮凝活性从而进行初筛，若絮凝，则初步判定有产生物絮凝剂的能力;絮凝培养基配制如下：NaNO31-3g，KC10-11g，K2HPO40.5-1.5g，MgSO40.3-0.7g，FeSO40.01g，蔗糖27-32g和蒸馏水1L，除FeSO4外，其余原料均在115-125℃灭菌15-25min，待灭完菌冷却后，将FeSO4溶解于灭菌后的蒸馏水中，过滤，再将过滤后的FeSO4溶液加入该培养基内;
(2)复筛
将初筛出的具有絮凝能力的菌株分别接种于絮凝培养基中培养，45-50h后，以絮凝率的大小作为衡量菌株产絮凝剂能力的大小，从中选出具有生物絮凝剂产生的蜡质芽孢杆菌。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的一种蜡质芽孢杆菌的应用，其特征在于：利用纺锤芽孢杆菌处理制革废水COD的方法包括以下步骤：
(l)培养基配制：NaNO31.5-2.5g，KC10-11g，K2HPO40.6-1.2g，MgSO40.3-0.7g，FeSO40.01g，蔗糖28-32g和蒸馏水1L，除FeSO4外，其余原料均在115-125℃灭菌15-25min，待灭完菌冷却后，将FeSO4溶解于灭菌后的蒸馏水中，过滤，再将过滤后的FeSO4溶液加入该培养基内;
(2)发酵：将蜡质芽孢杆菌菌种接种至装有50mL培养基的250mL摇瓶，放在转速为180r/min的摇床内，于32-38℃条件下振荡培养45-50h;培养后的菌种再接种至装有100mL培养基的250mL锥形瓶，然后于32-38℃条件下振荡培养24～68h得发酵液，菌种与培养基的接种量比例是体积比1:8-12;
(3)生物絮凝剂的提取：将发酵液放入转速为5000-10000r/min的离心机中，离心10min，收集上清液，然后在上清液中加入2-4倍体积的乙醇，所得混合物在3-5℃下静置5-7h后再将混合物放入转速为5000～10000r/min的离心机中，离心8-12min，收集沉淀，用蒸馏水溶解2.5-3.5h，将溶解液放入转速为5000～10000r/min的离心机中，离心8-12min，所得沉淀物再用蒸馏水溶解2-3h，反复透析1～2次，再将离心的沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得生物絮凝剂成品;
(4)废水处理：将生物絮凝剂加入装有制革废水的烧杯中，于磁力搅拌器上进行反应。
6.根据权利要求4或5中所述的一种蜡质芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述絮凝培养基或培养基的pH6.7-7.2。
7.根据权利要求5中所述的一种蜡质芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述步骤(3)中乙醇为预冷乙醇，温度3-5℃。
8.根据权利要求5中所述的一种蜡质芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述步骤(3)中离心机的转速为8000r/min。
说明书
一种蜡质芽孢杆菌在处理制革废水COD中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种蜡质芽孢杆菌(Bacilluscereus)在处理制革废水COD中的应用。
背景技术
皮革业是高污染行业，随着皮革工业产量的增加，制革工业排放的污染物也在不断增加，制革废水污染环境问题日益突出。
由于制革工艺的特点，决定了制革废水有机物浓度高、耗氧量大。据资料显示，制革废水污染在轻工业中排第三位，成为目前工业废水治理的难点与焦点之一。据估算，我国制革废水量大，年总耗水量为1.4亿吨左右，排水量在1.2亿吨左右;年排放的有害物质中，COD15万吨以上，制革工业综合废水的COD通常为3000-4000mg/L，污染问题成为对制革工业发展构成制约的最大问题之一。因而，研究开发经济、高效的COD治理技术已成为制革废水乃至水污染控制工程领域研究的重点和热点。
制革废水中COD处理方法主要为物理化学法、生化法和电化学法。但依然存在于对高浓度皮革水的处理针对性不强，去COD效率不高，且容易造成对环境第二次污染等问题。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种蜡质芽孢杆菌(Bacilluscereus)的应用，所述蜡质芽孢杆菌保藏号为CCTCCM2014513，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2014年10月26日，通过从蜡质芽孢杆菌菌种中提取出生物絮凝剂，并用该生物絮凝剂处理制革废水中的COD，绿色环保、不产生二次污染等，消除制革生产中产生的高浓度COD废水对环境的污染，并构建清洁的制革废水中COD处理新技术。
解决以上技术问题的一种蜡质芽孢杆菌的应用,其特征在于：保藏号为CCTCCM2014513，所述蜡质芽孢杆菌应用于降低制革废水中COD。
所述蜡质芽孢杆菌由制革厂的活性污泥中培育和驯化而得。
所述培育和驯化步骤如下：
(1)菌种的富集培养：
采集制革厂的活性污泥接种至已灭菌并冷却的LB培养基中，污泥与培养基的培养比例是体积比约1:8-12，于28-32℃摇床培养46-50h，LB培养基配制如下：蛋白胨8-12g，酵母膏4-7g，NaCl8-12g，加蒸馏水到1000mL，pH6.8-7.2，115-125℃灭菌15-25min;摇床转速是100r/min。
(2)菌种的驯化：
将5mL富集培养菌液接种于100mL含有制革废水的LB培养基中28-32℃振荡培养45-50h，并逐渐增加制革废水的量至40mL、60mL、80mL，逐级驯化;逐级驯化，其目的是为了使培养的菌种能够适应制革废水的高浓度COD。
通过步骤(1)培养后的活性污泥，即为富集培养菌液。
驯化过程中菌落是否驯化成功，是通过检测每一级驯化时培养前后含有制革废水的LB培养基的COD去除率是否始终维持在较高水平而定的，若COD去除率始终维持在较高水平，则可进行下一级驯化;在好氧反应器中进行驯化;驯化培养基都为LB培养基。
③菌种的分离：
通过稀释平板法，以固体LB培养基为分离培养基，从已驯化的菌液中分离出各种细菌，并对各菌株进行纯化。
稀释平板法。即：用无菌移液管吸取20mL已经驯化好的活性污泥，放入带有玻璃珠的三角烧瓶中，振荡，将各种菌的细胞充分分散(用显微镜观察，细胞呈单细胞)。用无菌吸管从中吸取1mL菌体悬浮液加入盛有9mL的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1mL加入另一盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，依此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同稀释度的菌体悬浮液。然后用无菌移液管分别吸取不同稀释度的稀释液于无菌培养皿内，再将已灭菌并冷却至45～50℃左右的LB固体培养基倾入到各无菌培养皿内，倾入培养基约为15mL。之后将培养皿在无菌操作台上轻轻前后左右转动，使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合均匀，混匀后静置。待平板冷却后，将平板倒置于37℃培养箱中培养1～2天。最后将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到LB培养基的试管斜面上。
纯化的步骤：将每个斜面中接种的菌株，通过前述稀释平板法分离步骤，反复分离菌种，直至所分离的菌种为纯培养，即菌苔长出后，其菌落特征一致即可。
优化方案，本发明中还有生物絮凝剂产生菌的筛选，所述培育和驯化还包括生物絮凝剂产生菌的筛选，如以下步骤：
(1)初筛
将分离纯化出的蜡质芽孢杆菌菌株接种于絮凝培养基中进行培养，将培养液离心，取上清液进行絮凝活性的初筛，即：取2mL培养液加入100mL4g/L高岭土悬浮液中，同时以不加培养液的高岭土悬浮液进行对照，观察，以是否出现絮凝来判断是否具有絮凝活性从而进行初筛，若絮凝，则初步判定有产生物絮凝剂的能力，需进一步检测培养液中絮凝剂的絮凝活性大小;絮凝培养基配制如下：NaNO31-3g，KC10-11g，K2HPO40.5-1.5g，MgSO40.3-0.7g，FeSO40.01g，蔗糖27-32g和蒸馏水1L，除FeSO4外，其余原料均在115-125℃灭菌15-25min，待灭完菌冷却后，将FeSO4溶解于灭菌后的蒸馏水中，过滤，再将过滤后的FeSO4溶液加入该培养基内;
(2)复筛
将初筛出的具有絮凝能力的菌株分别接种于絮凝培养基中培养，45-50h后，以絮凝率的大小作为衡量菌株产絮凝剂能力的大小，从中选出具有生物絮凝剂产生的蜡质芽孢杆菌。筛选出的蜡质芽孢杆菌既能产絮凝剂，有去除污染物的能力。
本发明中一种蜡质芽孢杆菌的应用，其特征在于：利用蜡质芽孢杆菌处理制革废水COD的方法包括以下步骤：
(l)培养基配制：NaNO31.5-2.5g，KC10-11g，K2HPO40.6-1.2g，MgSO40.3-0.7g，FeSO40.01g，蔗糖28-32g和蒸馏水1L，除FeSO4外，其余原料均在115-125℃灭菌15-25min，待灭完菌冷却后，将FeSO4溶解于灭菌后的蒸馏水中，用灭菌过滤器过滤溶解的FeSO4，用无菌移液管吸取过滤后的FeSO4溶液加入该培养基内;
(2)发酵：将蜡质芽孢杆菌菌种接种至装有50mL培养基的250mL摇瓶，放在转速为180r/min的摇床内，于32-38℃条件下振荡培养45-50h;培养后的菌种再接种至装有100mL培养基的250mL锥形瓶，然后于32-38℃条件下振荡培养24～68h得发酵液，菌种与培养基的接种量比例是体积比1:8-12;发酵液是指步骤(2)经过培养24～68h的培养液。
(3)生物絮凝剂的提取：将发酵液放入转速为5000-10000r/min的离心机中，离心10min，收集上清液，然后在上清液中加入2-4倍体积的乙醇，所得混合物在3-5℃下静置5-7h后再将混合物放入转速为5000～10000r/min的离心机中，离心8-12min，收集沉淀，用蒸馏水溶解3h，将溶解液放入转速为5000～10000r/min的离心机中，离心8-12min，所得沉淀物再用蒸馏水溶解2-3h，反复透析1～2次，至鼻子闻不到乙醇味为止，以去除小分子和残留的有机溶剂，最后将离心的沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，可得到生物絮凝剂成品;
(4)废水处理：将生物絮凝剂加入装有制革废水的烧杯中，于磁力搅拌器上进行反应;
所述絮凝培养基或培养基的pH6.7-7.2。
所述步骤(3)中乙醇为预冷乙醇，温度4℃。
所述步骤(3)中离心机的转速为8000r/min。
本发明中的蜡质芽孢杆菌经富集、驯化，适应了含有高浓度COD废水的环境，能在培养基中培养时分泌出一种代谢产物，即为生物絮凝剂;该生物絮凝剂因主要含有蛋白质、糖类、糖蛋白、糖胺和脂肪等大分子成分，通过离子键、氢键等作用与废水中的固体悬浮物相结合，同时因其具有一些活性基团，克服无机高分子和合成有机高分子絮凝剂本身固有的缺陷，能与废水中的污染物反应，达到去除污染物的目的。蛋白质、糖类、糖蛋白、糖胺和脂肪，而这些成分都是可生物降解的，无毒、无二次污染。
本发明用蜡质芽孢杆菌产生的生物絮凝剂处理废水，具有良好的凝聚作用和独特的脱色效果，适用范围广，易于生物降解，可消除二次污染，安全可靠，属于绿色环保产品。
本发明用蜡质芽孢杆菌产生的生物絮凝剂处理制革废水中的COD，发挥生物絮凝剂绿色环保、不产生二次污染等独特性能，开拓出了去除制革废水中COD的生物絮凝剂新种类，可以消除制革生产中产生的高浓度COD废水对环境的污染，并构建清洁的制革废水中COD处理新技术，从而为去除制革废水中的高浓度COD提供了新方法;此外，也拓宽了对蜡质芽孢杆菌功能方面的应用，使其具有较强的应用价值。
