申请日2014.01.13
公开(公告)日2014.04.23
IPC分类号C12N15/82; C02F3/32
摘要
一种高纬度城市生活污水植物水处理方法，它涉及一种生活污水的水处理方法。它采用外来入侵物种进行城市生活污水水处理，并利用转基因技术增强空心莲子草的氧结合能力和需氧量，使其可以处理污染程度高的生活污水水体;而且可以提高空心莲子草的耐寒性，令其可在高纬度地区应用，使冬季水处理时间延长、水处理效果提升。方法：一、构建植物表达载体;二、构建空心莲子草转基因植株;三、培育、繁殖空心莲子草转基因植株，再将其移植到高纬度污染水体中进行污水处理和修复。本发明应用于水环境工程领域。
权利要求书
1.一种高纬度城市生活污水植物水处理方法，其特征在于高纬度城市生活污水植物水处 理方法按以下步骤进行：
一、构建植物表达载体;
二、构建空心莲子草转基因植株;
三、培育、繁殖空心莲子草转基因植株，再将空心莲子草转基因植株移植到高纬度污染 水体中进行污水处理和修复;
其中，步骤一中植物表达载体中包含启动子super promoter和透明颤菌血红蛋白基因。
2.根据权利要求1所述的一种高纬度城市生活污水植物水处理方法，其特征在于步骤一 中选用载体p3300-Tnos构建植物表达载体。
3.根据权利要求1所述的一种高纬度城市生活污水植物水处理方法，其特征在于步骤一 中启动子super promoter的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.根据权利要求1所述的一种高纬度城市生活污水植物水处理方法，其特征在于步骤一 中透明颤菌血红蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
说明书
一种高纬度城市生活污水植物水处理方法
技术领域
本发明涉及一种生活污水的水处理方法。
背景技术
由于城市的快速发展和人口数量的不断增加，我国的生活污水越来越多。环保总局报告 显示，目前城市生活污水排放量以年均5%的速度递增，已超过工业污水排放量。生活污水不 但影响水质，对我们生活的环境更是一大危害。
空心莲子草(拉丁学名：Alternanthera philoxeroides(Mart.)Griseb.)，别名：革命草、水 花生、喜旱莲子草等，属苋科的一种植物。多年生草本;茎基部匍匐，上部上升，管状，不 明显4棱，长55～120厘米，具分枝，幼茎及叶腋有白色或锈色柔毛，茎老时无毛，仅在两侧 纵沟内保留。叶片矩圆形、矩圆状倒卵形或倒卵状披针形。具有药用价值。20世纪50～70年 代，随着养猪事业的发展，作为优良饲料在中国进行大力推广，上世纪80年代后期为野生， 自然蔓生面积迅速扩大。空心莲子草主要在农田(包括水田和旱田)、空地、鱼塘、沟渠、河 道等环境中生长为害，阻塞水上交通，封闭河塘水面，降低作物产量，影响农田排灌，被列 为中国首批外来入侵物种。
空心莲子草适应性强，既能扎根生于浅水中，也能漂浮于水面上;抗酸碱能力强，可在 pH值为3～12的环境中生长;并能耐受30%的盐浓度。但是被生活污染严重污染的水体中氧 气的含量低，成为制约空心莲子草进行植物水处理的一个瓶颈。而且，在高纬度地区冬季空 心莲子草虽然水下部分仍有活力，来年春天仍可萌发生长，但水面部分己冻死，由于高纬度 地区冬季时间长导致其难以在高纬度地区用于水体修复。
发明内容
本发明采用外来入侵物种进行城市生活污水水处理，并利用转基因技术增强空心莲子草 的氧结合能力和需氧量，使其可以处理污染程度高的生活污水水体;而且可以提高空心莲子 草的耐寒性，令其可在高纬度地区应用，使冬季水处理时间延长、水处理效果提升。
高纬度城市生活污水植物水处理方法按以下步骤进行：
一、构建植物表达载体;
二、构建空心莲子草转基因植株;
三、培育、繁殖空心莲子草转基因植株，再将空心莲子草转基因植株移植到高纬度污染 水体中进行污水处理和修复;
其中，步骤一中植物表达载体中包含启动子super promoter和透明颤菌血红蛋白基因。
本发明也利用高纬度地区冬季寒冷的自然条件对空心莲子草转基因植株的生长和蔓延进 行遏制，在利用空心莲子草的同时防止空心莲子草产生生态破坏。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组 合。
具体实施方式一：本实施方式高纬度城市生活污水植物水处理方法按以下步骤进行：
一、构建植物表达载体;
二、构建空心莲子草转基因植株;
三、培育、繁殖空心莲子草转基因植株，再将空心莲子草转基因植株移植到高纬度污染 水体中进行污水处理和修复;
其中，步骤一中植物表达载体中包含启动子super promoter和透明颤菌血红蛋白基因。
本实施方式中先将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的启动子super promoter导入到载体 p3300-Tnos中，然后将人工合成的透明颤菌血红蛋白基因(如SEQ ID NO：2所示)和导入 启动子super promoter的载体p3300-Tnos都用XbaI和SacI进行双酶切，之后进行连接，获 得植物表达载体。
本实施方式获得的植物表达载体分别用EcoRI和HindⅢ、XbaI和EcoRI、XbaI和SacI 进行双酶切，分别获得1.8kb、0.7kb和456bp三条条带，说明植物表达载体构建成功。
利用农杆菌转化法将植物表达载体导入农杆菌中，然后对目的基因(启动子super promoter和透明颤菌血红蛋白基因)进行检测与测定，选择成功表达的农杆菌导入空心莲子 草;之后利用抗生素进行转化植株的筛选，并利用PCR法进行转化植株的鉴定，含有启动子 super promoter和透明颤菌血红蛋白基因的为成功转化的空心莲子草转基因植株。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三中空心莲子草转基 因植株生根后，幼苗高度长到3cm进行移植。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中启动子super promoter导入到载体p3300-Tnos后获得质粒p3300-super promoter-Tnos，然后用碱裂解法提 取p3300-super promoter-Tnos质粒，再用XbaI和SacI进行双酶切，XbaI和SacI双酶切反应 体系为50μL，由20μL的质粒、0.5μL的限制性内切酶XbaI、0.5μL的限制性内切酶SacI、5μL 的10×共用酶切缓冲液和余量的ddH2O组成;双酶切反应：在30℃水浴锅中放置2h。其它步 骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中经过双酶切的人 工合成的透明颤菌血红蛋白基因和表达载体p3300-super promoter-Tnos进行连接，连接体系 为10μL，由6μL的人工合成的透明颤菌血红蛋白基因片段、2μL的载体p3300-super promoter-Tnos片段，1μL的T4DNA ligation buffer和1μL的T4DNA ligation组成;16℃连接 反应12h，获得植物表达载体。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二按以下步骤构建空 心莲子草转基因植株：
①农杆菌(LBA4404)感受态细胞的制备
1、从含有50mg/L Sm、50mg/L Rif的YEB的平板上挑取农杆菌LBA4404的单菌落;
2、接种于5mL含Sm和Rif的YEB液体培养基内，28℃，180r/min，振荡培养1～2d;
3、取菌液按1:10的比例重新接种于50mL含Sm和Rif的YEB中;
4、振荡培养6～8h，至对数生长期OD600≈0.5;
5、菌液置于冰上20～30min，分装于高压灭菌的1.5mL eppendorf管中;
6、4℃、5000r/min离心10min，弃上清;
7、沉淀加入800μL冰预冷的0.05mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴20～30min;
8、4℃、5000r/min离心10min，弃上清;
9、沉淀加入100μL冰预冷的0.05mol/L CaCl2重悬细胞;
10、置于4℃保存备用;
②冻融法转化农杆菌LBA4404
1、取农杆菌感受态细胞，加入3～4μL植物表达载体，轻轻混匀，置冰上30min;
2、液氮冷冻3～5min，迅速移至37℃水浴锅放置中2～3min融化;
3、加入800μL YEB，28℃振荡培养4～5h;
4、8000r/min离心5min，去上清，留下适量上清，将沉淀混匀，取100μL涂于含相应抗 生素YEB的平板上，28℃倒置暗培养48h。
③准备农杆菌侵染的受体材料
育苗：将空心莲子草的叶片用水清洗2～3遍后，用75%酒精对叶片进行表面消毒15～30s， 再用0.1%的升汞消毒30～60s，无菌水冲洗5遍，然后接种于MS0培养基中;
④农杆菌介导的遗传转化及抗性植株的再生
1、菌种活化
将农杆菌接种于加有Sm、Rif和Kan的LB固体培养基上，28℃培养箱中暗培养36～48h， 或至长出单菌落;挑取单菌落并接种于10mL含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃， 180r/min，振荡培养;待菌液长至对数生长期，即OD600=0.4～0.6，再次将菌液接种于含相应 抗生素的LB液体培养基中进行二次活化;
2、侵染
取出预培养的空心莲子草外植体放入活化好的农杆菌菌液中，浸泡10～15min，其间轻摇 几次;取出材料，用无菌水冲洗4～5次，然后用无菌滤纸吸去多余的液体;
3、共培养
将侵染后的外植体接种到MS0培养基中，28℃暗培养1～2d;
4、继代培养
外植体经共培养后，将其转移到分化培养基MS1中，28℃光培养，分化愈伤组织，约10d 左右继代一次;
5、筛选培养
继代培养2～3周后，外植体愈伤组织开始分化出抗性芽，将抗性芽转移到筛选培养基 MS2上，并继续进行继代培养;
6、抗性芽的生根培养
待芽长至3～4cm长，将其剪下并转入生根培养基MS3上，诱导生根，大约15～20d长出 不定根。其它步骤及参数与实施方式一相同。
实施例1
在高纬度地区进行对比试验：
试验地点：大庆市，大庆市位于黑龙江省西部，松辽盆地中央坳陷区北部，市区地理位 置北纬45°46'，东经124°19'至125°12'之间。试验生活污水采自大庆市萨南公园。
试验分为两种方案进行，第一种方案采用本发明的生活污水处理方法，第二种方案直接 采用未经过改造的普通空心莲子草处理生活污水;每种方案又采取3种不同的种植密度进行 试验，并选择一同纬度、同水质、同面积、同样条件的水域作为空白对照样。
2011年春天试验地点平均气温达到15℃将幼苗高为3cm的空心莲子草转基因植株和普 通空心莲子草植株移植到各自的污染水体中进行试验。
