申请日2014.02.26
公开(公告)日2015.08.12
IPC分类号C12N15/10
摘要
本发明涉及一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA的提取方法，步骤如下：(1)取活性污泥，然后加入氯化钠溶液洗涤，制得初洗污泥;(2)向初洗污泥中加入提取缓冲液和溶菌酶溶液;然后加入十二烷基硫酸钠溶液，离心取上清液;(3)加入Tris-饱和酚溶液，再加入Tris-饱和酚溶液，离心取上清，制得提取液A;(4)加入混合溶液I，再加入混合溶液II，离心取上清，加入乙酸钠溶液，再加入预冷无水乙醇，离心取沉淀，制得粗提物;(5)加入乙醇溶液，离心，收集沉淀，再加入TE缓冲液和RNaseA溶液，即得。本发明提高了活性污泥宏基因组DNA样品的产量和质量。
权利要求书
1.一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取0.5～2g活性污泥，离心，收集沉淀;然后加入5～20ml的质量浓度为0.9%的 氯化钠溶液洗涤1～5min，离心，收集沉淀，重复3～5次，制得初洗污泥;
(2)向步骤(1)制得的初洗污泥中加入600～2400μL提取缓冲液和20～80μL溶菌 酶溶液，混合均匀，36～38℃水浴保温25～40min;然后加入200～800μL的质量浓度为10% 的十二烷基硫酸钠溶液，混合均匀，离心，取上清液;
所述提取缓冲液含有浓度为80～120mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、浓度为80～120mmol/L 的乙二胺四乙酸二钠、浓度为150～250mmol/L的NaCl、质量浓度为1%的聚乙烯吡咯烷酮和 质量浓度为2%的十六烷基三甲基溴化铵，pH7.5～8.5;
(3)向步骤(2)的上清液中加入800～3300μL Tris-饱和酚溶液，混合均匀，离心， 取上清，再加入等体积500～2000μL Tris-饱和酚溶液，混合均匀，离心，取上清，制得提 取液A;
(4)向步骤(3)制得的提取液A中加入等体积混合溶液I，混合均匀，离心，取上清， 再加入等体积混合溶液II，混合均匀，离心，取上清，加入上清1/10～1/5体积的乙酸钠溶 液，再加入上清2～3倍体积的预冷无水乙醇，冰上放置30～40min;低温离心，取沉淀，制 得粗提物;
所述混合溶液I是酚、氯仿、异戊醇按体积比25:24:1的比例混合的混合溶液;
所述混合溶液II是氯仿、异戊醇按体积比25:1的比例混合的混合溶液;
(5)向步骤(4)制得的粗提物中加入500～2000μL的体积百分比为70%的乙醇溶液， 悬浮沉淀，离心，收集沉淀，重复1～3次;然后加入500～2000μL的无水乙醇，悬浮沉淀， 离心，收集沉淀，室温干燥，再加入60～240μL的TE缓冲液和3～12μL的RNaseA溶液， 制得宏基因组DNA。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中的离心，条件均为： 8000～10000g离心1～1.5min。
3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中溶菌酶溶液浓度为10～ 15mg/ml。
4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)、(3)和(4)中的离心， 条件均为：8000～10000g离心10～15min。
5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中的低温离心，条件为： -4～0℃，10000～12000g离心10～15min。
6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中的乙酸钠溶液浓度为 3mol/L，pH5.2。
7.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(5)中的离心，条件均为： 10000～12000g离心1～1.5min。
说明书
一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA的提取方法
技术领域
本发明涉及一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA的提取方法，属于生物技术 技术领域。
背景技术
环氧丙烷皂化废水是一种由氯醇法生产环氧丙烷过程产生的大量污水。根据相关报道， 每生产1t环氧丙烷就产生50-80t废水。该废水具有pH值高、氯化钙含量高、COD高的特点， 其中含有大量难以生化降解的氯化物，如氯丙醇、二氯异丙醚、二氯丙烷等。这种高盐、富 含有机物的废水可造成严重的环境污染，采用合理有效的方式处理这种废水不容忽视。
生物活性污泥法是当前环氧丙烷皂化废水处理的主要方式，但这种方法受到微生物活性 及其耐盐度的限制，处理效果有待提高。采用有效的方法研究分析活性污泥微生物群落的主 要的建群种，有针对性的进行驯化培养，可大大提高活性污泥菌种的活性及耐盐度，进而提 高活性污泥处理废水的工作能力。
活性污泥中微生物群落结构复杂，而且绝大多数的微生物是不能被传统方法分离培养的， 通过传统的富集、分离、培养很难对污泥微生物群落进行准确分析。宏基因组技术突破了传 统微生物培养的局限性，是当前进行微生物群落分析最有效的方式之一，而获得高质量的宏 基因组DNA，是准确分析微生物群落的必要条件。
中国专利文献CN101392248A(申请号200810064771.1)公开了一种厌氧活性污泥DNA 的提取方法，按照以下步骤进行：一、污泥清洗;二、裂解细胞;三、DNA的纯化;即提取出厌 氧活性污泥DNA。
中国专利文献CN102732504A(申请号201110096525.6)公开了一种由油/气藏复杂环境 样品中直接提取微生物宏基因组的简易方法，包括以有机相/水相萃取获得油样/油水样中微 生物组份，真空过滤水相富集微生物，以溶菌酶、蛋白酶、十二烷基硫酸钠(SDS)等裂解细胞， 在高盐条件下通过十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)去除蛋白质以及多糖等有机大分子组份，随 后通过核酸抽提及沉淀，获得无偏好的油/气藏微生物宏基因组成分。
但上述方法应用与环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA提取是，均出现DNA样品条 带弥散，无法获得较高质量的宏基因组DNA样本的问题。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA的提取 方法。
本发明的技术方案如下：
一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取0.5～2g活性污泥，离心，收集沉淀;然后加入5～20ml的质量浓度为0.9%的 氯化钠溶液洗涤1～5min，离心，收集沉淀，重复3～5次，制得初洗污泥;
(2)向步骤(1)制得的初洗污泥中加入600～2400μL提取缓冲液和20～80μL溶菌 酶溶液，混合均匀，36～38℃水浴保温25～40min;然后加入200～800μL的质量浓度为10% 的十二烷基硫酸钠溶液，混合均匀，离心，取上清液;
所述提取缓冲液含有浓度为80～120mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、浓度为80～120mmol/L 的乙二胺四乙酸二钠、浓度为150～250mmol/L的NaCl、质量浓度为1%的聚乙烯吡咯烷酮和 质量浓度为2%的十六烷基三甲基溴化铵，pH7.5～8.5;
(3)向步骤(2)的上清液中加入800～3300μL Tris-饱和酚溶液，混合均匀，离心， 取上清，再加入等体积500～2000μL Tris-饱和酚溶液，混合均匀，离心，取上清，制得提 取液A;
(4)向步骤(3)制得的提取液A中加入等体积混合溶液I，混合均匀，离心，取上清， 再加入等体积混合溶液II，混合均匀，离心，取上清，加入上清1/10～1/5体积的乙酸钠溶 液，再加入上清2～3倍体积的预冷无水乙醇，冰上放置30～40min;低温离心，取沉淀，制 得粗提物;
所述混合溶液I是酚、氯仿、异戊醇按体积比25:24:1的比例混合的混合溶液;
所述混合溶液II是氯仿、异戊醇按体积比25:1的比例混合的混合溶液;
(5)向步骤(4)制得的粗提物中加入500～2000μL的体积百分比为70%的乙醇溶液， 悬浮沉淀，离心，收集沉淀，重复1～3次;然后加入500～2000μL的无水乙醇，悬浮沉淀， 离心，收集沉淀，室温干燥，再加入60～240μL的TE缓冲液和3～12μL的RNaseA溶液， 制得宏基因组DNA。该宏基因组DNA需置于-20℃进行冷冻保存。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的离心，条件均为：8000～10000g离心1～1.5min。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中溶菌酶溶液浓度为10～15mg/ml。溶菌酶的作用是 通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶 性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶为市售产品， 本领域技术人员可以根据该溶菌酶的目的选择合适厂家生产的溶菌酶。
根据本发明优选的，所述步骤(2)、(3)和(4)中的离心，条件均为：8000～10000g 离心10～15min。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中的低温离心，条件为：-4～0℃，10000～12000g 离心10～15min。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中的乙酸钠溶液浓度为3mol/L，pH5.2。
根据本发明优选的，所述步骤(5)中的离心，条件均为：10000～12000g离心1～1.5min。
如无特殊说明，上述工艺条件均可采用本领域惯用条件，常用试剂如：Tris-饱和酚溶液、 TE缓冲液、RNaseA溶液等如无特殊说明，均采用本领域常用试剂。
有益效果
本发明克服了现有宏基因组DNA提取方法无法提取环氧丙烷皂化废水活性污泥中宏基因 组DNA的弊端，通过采用质量浓度为0.9%的氯化钠溶液—提取缓冲液—溶菌酶—十二烷基硫 酸钠溶液对活性污泥样品进行预处理和微生物细胞壁破碎，将获得的高纯度、高含量的宏基 因组DNA样品用酚、氯仿、异戊醇的混合溶液反复多次处理，并将上述处理后DNA样品进行 无水乙醇/乙酸钠沉淀提取获得宏基因组DNA。本发明所述方法大大提高了活性污泥宏基因组 DNA样品的产量和质量，获得丰富度较高的环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA样品， 并且操作简单、可行性强，成本低，具有广阔的应用前景。
