申请日2013.10.15
公开(公告)日2014.02.05
IPC分类号C12Q1/68; C12R1/01; G01N21/64
摘要
一种污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，属于污水生物处理技术领域。本发明可以对污水处理厂中两个属的亚硝酸盐氧化菌，即硝化菌属和硝化螺菌属进行检测，不仅可以分析总的亚硝酸盐氧化菌，而且可以分析各个属的动态变化。采用通用性好、成本较低的SYBR Green荧光染料法建立了亚硝酸盐氧化菌2个属的实时荧光定量PCR标准曲线。2条标准曲线的相关系数分别为0.998和0.997，扩增效率在100%到110%之间。利用建立的标准曲线对某污水处理系统中亚硝酸盐氧化菌进行监控和鉴定。本发明提供了一种经济、简便、可靠的污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法。
权利要求书
1.一种污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：污水 生物处理系统中的亚硝酸盐氧化菌包括硝化菌属和硝化螺菌属，分别定量检测这两个属的 微生物数量，二者数量之和是亚硝酸盐氧化菌的总量;提取实际生活污水处理系统中活性 污泥微生物的基因组DNA;采用硝化菌属和硝化螺菌属16S rDNA引物进行常规PCR扩 增;将两个属的纯化回收的DNA扩增片段与载体连接，连接好的载体导入感受态细胞培 养15-18h，挑取白斑进行重组菌落PCR验证;提取包含目的片段的质粒用作实时荧光定 量PCR的标准品，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，建立标准曲线;利用建立的标准 曲线对污水处理厂中亚硝酸盐氧化菌进行定量检测;
上述常规PCR扩增体系如下：
上述实时荧光定量PCR扩增反应体系如下：
当检测硝化菌属时采用硝化菌属的正向引物为TGCGACCGGTCATGG，反向引物为 GGGCGGWGTGTACAAGGC;当检测硝化螺菌属时采用硝化螺菌属的正向引物为 CCTGCTTTCAGTTGCTACCG，反向引物为GTTTGCAGCGCTTTGTACCG;
上述硝化菌属常规PCR和实时荧光定量PCR扩增程序如下：95℃处理10min;35个 循环反应，每个循环包括95℃1min，62℃1min，72℃2min;硝化螺菌属常规PCR和实 时荧光定量PCR扩增程序如下：95℃处理10min;35个循环反应，每个循环包括95℃1min， 60℃1min，72℃2min。
说明书
污水处理厂亚硝酸盐氧化菌荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法， 属于污水生物处理技术领域，用于对污水生物处理系统中亚硝酸盐氧化菌的定量 检测。
背景技术
污水生物脱氮技术由于经济、高效的特点而广泛应用于污水处理领域。 传统污水生物脱氮的原理是指氨氮被氨氧化菌氧化成亚硝态氮(亚硝化阶 段)，再由亚硝酸盐氧化菌氧化成硝态氮(硝化过程);之后硝态氮和亚硝态 氮被反硝化成氮气(反硝化过程)，从而实现污水中氮的去除。对于传统生 物脱氮技术而言，亚硝酸盐氧化菌作为硝化过程的主要功能微生物之一，在 污水生物处理系统内的生物活性和菌群分布的稳定性，是保证污水生物脱氮 系统稳定运行的关键因素。污水生物处理系统中的亚硝酸盐氧化菌包括硝化 菌属和硝化螺菌属，有的污水处理系统中只含有其中的一个属，而有的污水 处理系统中含有两个属。为了全面了解系统中的亚硝酸盐氧化菌的分布情 况，需要分别定量检测这两个属的微生物数量，二者数量之和是亚硝酸盐氧 化菌的总量。近年来，在传统生物脱氮理论的基础上产生了短程脱氮新理论， 即将硝化过程控制在亚硝态氮，然后直接进入反硝化，从而使生化反应大大 缩短，被称之为短程硝化反硝化。相比于传统方法，短程脱氮理论上减少25% 硝化需氧量、40%反硝化碳源，更具实用价值。实现短程脱氮的关键是将硝 化产物控制为亚硝酸盐，即去除亚硝酸盐氧化为硝酸盐的过程。从微生物学 的观点来看，就是抑制或淘汰亚硝酸盐氧化菌。对于短程脱氮技术而言，准 确监测并定量亚硝酸盐氧化菌的动态变化是实现短程脱氮并保证其稳定运 行的关键。分子生物技术的快速发展为污水生物处理系统内微生物研究提供 了新的分析方法和手段。因此，采用分子生物技术对不同工艺、水质条件下 的亚硝酸盐氧化菌菌群结构、活性等进行研究分析，能够为污水生物脱氮系 统的长期稳定运行提供有力保障。
实时荧光定量PCR技术作为一种核酸定量的手段，以其高灵敏性、高特 异性、高精确度、实时性、污染少等优点，逐渐应用于污水生物处理系统中 特定菌群的定量分析。已有的实时定量PCR技术应用于污水短程生物脱氮的 研究，主要是对氨氧化菌的定量。但实现短程脱氮的关键在于亚硝酸盐氧化 菌是否被抑制或淘汰。对于亚硝酸盐氧化菌，往往通过亚硝酸盐积累率达到 较高的水平(>80%)逆推出亚硝酸盐氧化菌被成功淘洗的结论。这种逆推显 然不够严谨，因为它无法揭示亚硝酸盐氧化菌是活性受到抑制还是已被彻底 淘洗出系统，这两种情况将会产生两种不同的运行效果。如果是亚硝酸盐氧 化菌的活性受到抑制，当环境条件的变化有利于生长时亚硝酸盐氧化菌将恢 复活性，导致短程脱氮运行不稳定甚至完全破坏。如果是亚硝酸盐氧化菌已 被彻底淘洗出系统，则更加有助于短程脱氮的稳定运行，短期的环境条件的 变化不会对短程脱氮产生影响。由于缺少对污水处理系统中亚硝酸盐氧化菌 的检测，对于不同运行条件下系统中亚硝酸盐氧化菌的群落结构及其动态变 化不清楚，进而无法准确阐述短程脱氮的形成机制。
本发明采用实时荧光定量PCR技术对污水处理厂中的亚硝酸盐氧化菌 进行定量检测。本发明在技术上不同于现有技术，主要体现在以下三方面：
(1)标准品DNA的来源。现有技术主要是从纯培养或人工配水富集的 目标菌中提取基因组DNA，或是化学合成DNA片段作为标准品。目标菌的 纯培养需要较长的时间、费用较高。更难以解决的是亚硝酸盐氧化菌中的硝 化螺菌属目前还无法实现纯培养。人工配水富集的目标菌的菌群单一，无法 获得实际污水处理系统中亚硝酸盐氧化菌的所有优势属的标准品。化学合成 DNA片段作为标准品首先要通过基因测序知道目标基因序列，否则无法合 成。而本发明采用的标准品全部来源于处理实际生活污水的反应器，无需目 标菌的纯培养、人工配水富集目标菌和目标基因序列。
(2)定量检测的环境样品及目标微生物。①目前，实时荧光定量PCR 主要应用于生命科学、医学等领域对病毒、致病菌的检测分析。而本发明的 待测样品为污水处理系统中的活性污泥，样品本身具有极强的特殊性。由于 活性污泥受废水污染，其中含有大量未知的有机、无机污染物、颗粒物、杂 质等，还有其它与亚硝酸盐氧化菌共存于活性污泥中的菌胶团，对DNA的 提取纯化干扰较大，并进而影响后续的PCR扩增。因此，活性污泥微生物基 因组DNA的提取方法、PCR扩增体系及反应条件需要特殊确定，难度较大。 ②本发明定量检测的目标微生物是亚硝酸盐氧化菌，已有研究证实污水生物 处理系统中的亚硝酸盐氧化菌包括两个属，即硝化菌属和硝化螺菌属。由于 本发明的标准品来自于实际污水处理系统，运行条件和废水成分的复杂性使 得亚硝酸盐氧化菌菌群丰富，获得两个主要属的标准品，因此能够对污水处 理厂中亚硝酸盐氧化菌进行全面的定量分析。
(3)实验条件的优化。采用实时荧光定量PCR方法对环境样品的特定菌 群密度进行定量过程中，样品预处理方法和参数的选择对于测定结果有较大 的影响。将实时荧光定量PCR应用于污水处理厂主要功能微生物亚硝酸盐氧 化菌的检测，待测样品为污水处理系统中的活性污泥。由于亚硝酸盐氧化菌 以污水为生存基质，污水中含有大量未知的有机、无机污染物、颗粒物、杂 质等，对DNA的提取纯化干扰较大，并进而影响后续的PCR扩增。因此本 申请对分析难度较大的亚硝酸盐氧化菌不同属的实验条件进行了探索和优 化，并获得了较好的扩增效果和定量结果。
故本发明提取实际生活污水处理系统中活性污泥微生物的基因组DNA， 采用硝化菌属和硝化螺菌属16S rDNA引物，建立检测亚硝酸盐氧化菌两个 属的实时荧光定量PCR标准曲线。利用建立的标准曲线对污水全程脱氮除磷 和短程脱氮除磷系统中的亚硝酸盐氧化菌进行定量检测，分析运行条件变化 过程中亚硝酸盐氧化菌群落的动态变化与系统运行的相关性，揭示亚硝酸盐 氧化菌被淘洗的过程和形成短程硝化的机制，未见相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经济、可靠的污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时 荧光定量PCR检测方法，对污水处理厂中两个属的亚硝酸盐氧化菌，即硝化菌 属和硝化螺菌属进行检测，不仅可以分析总的亚硝酸盐氧化菌，而且可以分析 各个属的动态变化。利用SYBR Green荧光染料法，无需设计多个探针即可检 测多个基因，通用性好、成本低，并且可同时进行大批量的样本分析。可用于 污水处理厂亚硝酸盐氧化菌菌群数量的监控和鉴定，具有很好的应用前景。
本发明的技术方案：
一种污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于： 亚硝酸盐氧化菌包括硝化菌属和硝化螺菌属，污水生物处理系统中的亚硝酸盐氧 化菌包括硝化菌属和硝化螺菌属，分别定量检测这两个属的微生物数量，二者数 量之和是亚硝酸盐氧化菌的总量;提取实际生活污水处理系统中活性污泥微生物 的基因组DNA;采用硝化菌属和硝化螺菌属16S rDNA引物进行常规PCR扩增 和琼脂糖凝胶电泳检验，切胶纯化回收DNA扩增片段，获得硝化菌属和硝化螺 菌属的扩增片段;将两个属的纯化回收的DNA扩增片段与载体连接，连接好的 载体导入感受态细胞培养15-18h，挑取白斑进行重组菌落PCR验证;提取包含 目的片段的质粒用作实时荧光定量PCR的标准品，在实时荧光定量PCR仪上进 行扩增，建立标准曲线;利用建立的标准曲线对污水处理厂中亚硝酸盐氧化菌进 行定量检测;
上述常规PCR扩增体系如下：
上述实时荧光定量PCR扩增反应体系如下：
当检测硝化菌属时采用硝化菌属的正向引物为TGCGACCGGTCATGG，反 向引物为GGGCGGWGTGTACAAGGC;当检测硝化螺菌属时采用硝化螺菌属的 正向引物为CCTGCTTTCAGTTGCTACCG，反向引物为 GTTTGCAGCGCTTTGTACCG;
上述琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖质量百分比浓度为2%，电泳电压为120V，电 泳时间为60min;
上述硝化菌属常规PCR和实时荧光定量PCR扩增程序如下：95℃处理 10min;35个循环反应，每个循环包括95℃1min，62℃1min，72℃2min;硝 化螺菌属常规PCR和实时荧光定量PCR扩增程序如下：95℃处理10min;35个 循环反应，每个循环包括95℃1min，60℃1min，72℃2min。
本发明的有益效果：
从控制点源污染入手，严格限制排放到地表水体的污水中的氮、磷浓度是减 轻水体富营养化的根本措施。污水生物脱氮，无论是全程脱氮方式还是短程脱氮 方式，亚硝酸盐氧化菌的监测都是保证处理系统稳定运行的关键。本发明提供了 一种经济、简便、可靠的污水处理厂中亚硝酸盐氧化菌2个属的实时荧光定量 PCR检测方法，能够从属的水平对污水生物脱氮系统中亚硝酸盐氧化菌的动态 变化进行分析，既可用于城市污水处理厂日常运行的微生物监控，保证生物脱氮 效果;又可用于实验室有关亚硝酸盐氧化菌的定量分析、代谢机制、基因表达解 析的研究，具有较强的实用性。
本发明通过提取实际污水处理系统中活性污泥微生物的基因组DNA，采用 亚硝酸盐氧化菌的2个属，即硝化菌属和硝化螺菌属的16S rDNA引物进行常规 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检验，切胶纯化回收DNA扩增片段，获得2个属的 PCR产物。将纯化产物经质粒转化和克隆培养后，提取包含目的片段的质粒DNA 作为实时荧光定量PCR检测硝化菌属和硝化螺菌属的标准品。在实时荧光定量 PCR仪上进行检测，建立标准曲线。2条实时荧光定量PCR标准曲线均呈现良 好的线性关系，相关系数、斜率与扩增效率如表1所示，该方法符合精确定量的 要求。可以利用建立的标准曲线对未知样品中亚硝酸盐氧化菌2个属的菌群数 量进行定量检测。本发明成功建立了亚硝酸盐氧化菌2个属的实时荧光定量 PCR标准曲线，使单独研究不同属对环境的动态响应成为可能。而且利用SYBR Green荧光染料法，检测成本降低，便于推广应用。
表1硝化菌属和硝化螺菌属定量PCR标准曲线的相关系数、斜率与扩增效率
本发明的创新点：
(1)本发明提取实际生活污水处理系统中活性污泥微生物的基因组DNA 作为标准品DNA的来源，同时获得了亚硝酸盐氧化菌2个属的标准品。与人工 配水系统相比，菌群更为丰富。标准品的制备无需目标菌的纯培养和人工富集， 操作简单、成本降低。
(2)本发明的定量方法不仅可以对总的亚硝酸盐氧化菌进行定量分析，还 可以对2个属，即硝化菌属和硝化螺菌属分别定量，对监测污水处理厂亚硝酸盐 氧化菌菌群动态变化具有更强的适用性，为污水处理厂的长期稳定运行提供有 力保障。获得的实时荧光定量PCR标准曲线，线性良好，扩增效率高，符合精 确定量的要求。利用SYBR Green荧光染料法，通用性好，检测成本低。
