申请日2018.01.10
公开(公告)日2018.06.29
IPC分类号G01N33/569; G01N33/535; G01N21/76; G01N21/64
摘要
本发明公开一种基于基因重组发光菌的工业废水生物毒性检测方法，属于环境监测技术领域。该方法选用发光菌Escherichia coli HB101 pUCD607作为检测用细菌，包括以下步骤：第一步，制备发光菌的菌悬液。第二步，样品梯度稀释。第三步，样品综合毒性测定。本发明的方法对pH范围要求不严格，不需要调节盐度，适合于不同pH条件下工业废水的发光菌综合毒性测试，对工业废水的综合毒性十分敏感。本发明建立了发光菌的微孔板测试方法，采样白色96孔板为实验容器在酶标仪上进行生物发光强度的检测，每块板的96个孔可以同时测定，而且所需样品体积可以从10mL缩小为250μL，实验操作简单便捷、快速。
权利要求书
1.一种基于基因重组发光菌的工业废水生物毒性检测方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步，制备发光菌的菌悬液：取冻存菌种，解冻后离心，去掉上清液后进行培养，第一次复苏液重新接种到新培养液，再次培养至一定OD值，离心后弃去上清液，制成菌悬液备用;
第二步，样品梯度稀释：先将工业废水从原液按10倍稀释比例依次稀释，初步检测毒性后，确定最佳稀释范围，然后从最佳稀释范围的上限依次按2倍梯度进行样品稀释;
第三步，样品综合毒性测定：转移稀释后的样品至酶标板，空白对照和标准对照同时进行，加入菌悬液后通过酶标仪测定生物发光强度;
所述的发光菌为Escherichia coli HB101 pUCD607。
2.根据权利要求1所述的基于基因重组发光菌的工业废水生物毒性检测方法，其特征在于：
第一步中所述的OD值为OD550=0.6～1。
3.根据权利要求1所述的基于基因重组发光菌的工业废水生物毒性检测方法，其特征在于：
第三步中所述的酶标板为96孔酶标板。
说明书
一种基于基因重组发光菌的工业废水生物毒性检测方法
技术领域
本发明属于环境监测技术领域，具体涉及一种基于基因重组发光菌的工业废水生物毒性检测方法。
背景技术
工业废水对水生态系统的危害程度一般用综合毒性指标进行表征，该指标在废水处理、排放和监管方面具有重要意义。常规理化检测方法只能提供少数特定目标污染物的含量数据，难以评价废水的综合毒性。生物毒性检测方法能够反映污染负荷和生物学反应之间的定量关系，体现的是复杂体系中所有组分的综合作用，包括各组分之间可能存在的加合作用、拮抗作用或协同作用。
发光菌暴露于有毒有害的工业废水中时，发光强度受到抑制，且发光强度被抑制的程度与综合毒性强度具有相关性。发光菌是一类正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌。发光过程是细菌体内的一种新陈代谢过程，即氧化呼吸链上的光呼吸过程。在细菌荧光酶的催化作用下，菌体中的还原型黄素单核苷(FMNH2)和分子氧及一长链醛发生氧化还原反应，生成黄素单核苷(FMN)、羧酸(RCOOH)和水，并伴随光的释放。当发光菌接触到工业废水中有毒污染物质时，可影响或干扰细菌的新陈代谢，从而使细菌的发光强度下降。利用发光细菌的这一特性，以发光强度的变化为指标，来检测工业废水中有毒有害物质的生物毒性。
发光菌毒性实验因其反应时间短、灵敏度高等优点而备受关注，用发光菌来检测水体毒性现已成为一种简单、快速的生物毒性检测手段。目前国内外研究较多的是明亮发光杆菌、青海弧菌和费氏弧菌等。20世纪80年代发展起来的Microtox法是以海洋发光菌Vibrio fishieri为指示生物进行毒性测试，该方法快速经济，应用较为广泛。但其pH范围要求严格(6～8)，且海洋发光菌因其在测试时需加一定量的NaCl(2%～3%)，而不适合淡水水体的毒性测试。明亮发光杆菌是我国常用的海洋发光菌，pH适应范围窄，必须将样品pH调至7.3～7.5后才能测定，可能导致样品毒性失真。工业废水成分复杂，pH范围变化大，因此有必要发展一种更适合于工业废水的发光菌综合毒性测试方法。
发明内容
为了克服现有的海水发光菌毒性测试技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于基因重组发光菌的工业废水生物毒性检测方法。该方法对pH范围要求不严格，不需要调节盐度，适合于不同pH条件下工业废水的发光菌综合毒性测试。该方法克服了海水发光菌对pH和盐要求严格，导致急性毒性检测结果失真的局限性。具体方法选用发光菌Escherichia coli HB101 pUCD607作为检测用细菌，包括以下步骤：第一步，制备发光菌的菌悬液。第二步，样品梯度稀释。第三步，样品综合毒性测定。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于基因重组发光菌的工业废水生物毒性检测方法，所述方法选用Escherichia coli HB101 pUCD607作为检测用细菌，包括以下步骤：
第一步，制备发光菌的菌悬液：取冻存菌种，解冻后离心，去掉上清液后进行培养，第一次复苏液重新接种到新培养液，再次培养至一定吸光度(OD)值，离心后弃去上清液，制成菌悬液备用;
第二步，样品梯度稀释：先将工业废水从原液按10倍稀释比例依次稀释，初步检测毒性后，确定最佳稀释范围，然后从最佳稀释范围的上限依次按2倍梯度进行样品稀释;
第三步，样品综合毒性测定：转移稀释后的样品至酶标板，空白对照和标准对照同时进行，加入菌悬液后通过酶标仪测定生物发光强度。
本发明所用的发光菌是一株基因工程菌，名称为Escherichia coli HB101pUCD607。此菌株基因组中插入了一个带有luxCDABE基因的质粒pUCD607。
优选的，第一步中所述的吸光度(OD)值为OD550=0.6～1。
优选的，第三步中所述的酶标板为96孔酶标板。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明所用发光菌Escherichia coli HB101pUCD607是目前国内适合不同pH条件下工业废水的发光菌，对工业废水的综合毒性十分敏感。
(2)本发明建立了发光菌的微孔板测试方法，采样白色96孔板为实验容器在酶标仪上进行生物发光强度的检测，每块板的96个孔可以同时测定，而且所需样品体积可以从10mL缩小为250μL，实验操作简单便捷、快速。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明一般实施方式：
主要仪器和耗材：酶标仪、恒温空气浴振荡摇床、超净工作台、移液枪、多通道移液器、旋涡混合器、平板振荡器、白色平底96孔板、加样槽、计时器、EP管、锥形瓶。
主要试剂：硫酸卡那霉素、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、氯化钾、硫酸锌。
主要溶液配制：
本方法所使用试剂除另有说明外，均应为符合国家标准的分析纯试剂、蒸馏水或同等纯度的水。
(1)0.3g/L的卡那霉素母液：3mg卡那霉素溶于10mL蒸馏水中，单独过滤除菌，分装于1.5mL EP管中，-20℃保存。取一管放在4℃解冻后待用。
(2)含有30μg/L卡那霉素的LBG培养液：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，1g葡萄糖溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌20min;待冷却到室温后，添加100μL卡那霉素(0.3g/L)，4℃冰箱保存。
(3)0.1M KCl溶液：7.45g KCl溶于1000mL水中，高压灭菌后置于4℃待用。
(4)2M KCl溶液：14.9g KCl溶于100mL水中，高压灭菌后置于4℃待用。
(5)ZnSO4母液：10000mg Zn/L(每升加1M的HCl 1mL酸化)。用母液配制不同浓度的Zn标准溶液作为发光菌实验质量控制。
(6)30μg/L卡那霉素的LB固体培养基：配制100mL LB液体培养基，加入1.2-1.5g琼脂粉，121℃高压灭菌20min;待冷却到50℃，添加10μL卡那霉素(0.3g/L)，混匀，倒平板。
菌种的复苏：此操作均在超净工作台中无菌条件下进行，并且保持温度在25℃。从-20℃冰箱中取出E.coli HB101pUCD607冻存管，置于4℃解冻，离心后去掉上清液，加入1mL LB培养液，混匀后接入10mL含30μg/L卡那霉素的LB液体培养基中。或者取一小勺发光菌冻干粉加入10mL无菌0.1M KCl中于25℃轻轻震动复苏1h。在添加了30μg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，25℃培养24～48h。挑取单菌落接种于10mL含30μg/L卡那霉素的LB液体培养基中。在摇床上于25℃、180r/min培养16h左右。
然后取200μL菌液到200mL LB培养液中，在摇床上25℃、180r/min培养16h左右，直到OD550为0.6～1，发光值>100000。然后将所得菌液在4000g，4℃下离心10分钟，弃去上清液。将发光菌重新悬浮在20mL 0.1M KCl中备用。可根据实际需要确定扩大培养的量。
样品梯度稀释：采用100mL量筒将工业废水从原液按10倍稀释比例依次稀释至0.01%(此处为举例，具体稀释最大比例视废水毒性强度而定)，初步检测毒性后，确定最佳稀释范围。然后从最佳稀释范围的上限依次按2倍梯度进行样品稀释，待测。
毒性测试：实验采用白色不透明平底96孔酶标板为反应容器。为了避免实验中的时间误差，第一横排为空白对照，即用质量控制：发光菌实验中的温度和pH等条件都可能对实验结果产生影响。本发明选取Zn作为参照毒物，见表1，每块酶标板的前4列都是测定一系列浓度的Zn溶液(0、0.05、0.1、0.5、1、2、6和10mg/L)的发光抑制率，并算出其EC50值，剂量效应曲线应为拟合度较高的S型曲线，且EC50值应在一定的范围内(0.6～1.2mg/L，该范围由本实验室多次测定的EC50值来确定)以确保实验的有效性、准确性和可重复性。
数据分析：发光菌的相对发光抑制率计算公式如下：
发光相对抑制率(%)=(对照发光强度–样品发光强度)/对照发光强度×100%。
实施例中所用的Escherichia coli HB101 pUCD607在文献“工业废水毒性鉴定评价方法体系的建议及其应用示例.2011,20(3):549-559”中公开。
